Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 6831-3:2010 về Chất lượng nước – Xác định ảnh hưởng ức chế của mẫu nước đến sự phát quang của vi khuẩn Vibrio fischeri (phép thử vi khuẩn phát quang) – Phần 3: Phương pháp sử dụng vi khuẩn đông – khô

TIÊU CHUẨN QUỐC GIA

rnrn

TCVN 6831-3:2010

rnrn

ISO 11348-3:2007

rnrn

CHẤT LƯỢNG NƯỚC – XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦArnMẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁT QUANG CỦA VI KHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VIrnKHUẨN PHÁT QUANG) – PHẦN 3: PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN ĐÔNG-KHÔ

rnrn

Waterrnquality – Determination of the inhibitory effect of water samples on the lightrnemission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) – Part 3: Method usingrnfreeze – dried bacteria

rnrn

Lời nói đầu

rnrn

TCVN 6831-3:2010 thay thếrnTCVN 6831-3:2001 (ISO 11348-3:1998).

rnrn

TCVN 6831-3:2010 hoàn toànrntương đương ISO 11348-3:2007.

rnrn

TCVN 6831-3:2010 do Ban kỹrnthuật Tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC 146 Chất lượng nước biên soạn, Tổngrncục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học và Công nghệ công bố.

rnrn

Bộ Tiêu chuẩn TCVN 6831 Chấtrnlượng nước – Xác định ảnh hưởng ức chế của mẫu nước đến sự phát quang của virnkhuẩn Vibrio fischeri (phép thử vi khuẩn phát quang) gồm các tiêu chuẩnrnsau:

rnrn

– TCVN 6831-1:2010 (ISOrn11348-1:2007), Phần 1: Phương pháp sử dụng vi khuẩn mới nuôi cấy;

rnrn

– TCVN 6831-2:2010 (ISOrn11348-2:2007), Phần 2: Phương pháp sử dụng vi khuẩn khô lỏng;

rnrn

– TCVN 6831-3:2010 (ISOrn11348-3:2007), Phần 3: Phương pháp sử dụng vi khuẩn đông khô.

rnrn

Lời giới thiệu

rnrn

Phép đo quy định trong bộ TCVN 6831rn(ISO 11348) có thể tiến hành sử dụng vi khuẩn mới nuôi cấy, cũng như vi khuẩnrnđông khô hoặc khô lỏng.

rnrn

Công việc tiêu chuẩn hóa do DINrnNormenausschuss Wasserwesen và ISO/TC 147/SC 5/WG 1 tiến hành đã cho thấy,rntrong trường hợp đặc biệt, các kỹ thuật khác nhau này có thể cho kết quả khácrnnhau, đặc biệt khi có mặt kim loại nặng.

rnrn

Độ nhạy thay đổi là do sự khác nhaurntrong thành phần môi trường sử dụng để chuẩn bị vi khuẩn đông khô hoặc khôrnlỏng. Các môi trường bảo vệ này ảnh hưởng đến tính có sẵn sinh học của các chấtrnđộc và/hoặc sự phát quang của vi khuẩn phát quang. Điều này có nghĩa là nguồnrngốc và phương pháp chuẩn bị vi khuẩn cần được xem xét khi biểu thị kết quả. Đôirnkhi, việc này có thể khó khăn, vì vi khuẩn đông khô và khô lỏng có thể do cácrnnhà cung cấp khác nhau. Do vậy, việc này có nghĩa là thành phần chi tiết khôngrnđược biết và do vậy người sử dụng không thể diễn giải được.

rnrn

Vì lý do này, ngoài phép đo độcrntính dùng vi khuẩn khô lỏng TCVN 6831-2 (ISO 11348-2) và vi khuẩn mới nuôi cấyrnTCVN 6831-1 (ISO 11348-1), quy trình dùng vi khuẩn đông khô được mô tả trongrntiêu chuẩn này, tính năng thực hiện của quy trình có thể do người sử dụng diễnrngiải trong từng chi tiết.

rnrn

Phòng thí nghiệm chịu trách nhiệmrnvề kết quả có cơ hội để lựa chọn kỹ thuật phù hợp nhất dựa trên các lời khuyênrncủa chuyên gia và thông tin về mẫu nước thử nghiệm.

rnrn

rnrn

CHẤTrnLƯỢNG NƯỚC – XÁC ĐỊNH ẢNH HƯỞNG ỨC CHẾ CỦA MẪU NƯỚC ĐẾN SỰ PHÁT QUANG CỦA VIrnKHUẨN VIBRIO FISCHERI (PHÉP THỬ VI KHUẨN PHÁT QUANG) – PHẦN 3: PHƯƠNGrnPHÁP SỬ DỤNG VI KHUẨN ĐÔNG-KHÔ

rnrn

Waterrnquality – Determination of the inhibitory effect of water samples on the lightrnemission of Vibrio fischeri (Luminescent bacteria test) – Part 3: Method usingrnfreeze – dried bacteria

rnrn

CẢNH BÁO – Người sử dụng tiêurnchuẩn này cần phải thành thạo với các thực hành trong phòng thì nghiệm thôngrnthường. Tiêu chuẩn này không đề cập tới mọi vấn đề an toàn liên quan đến ngườirnsử dụng. Trách nhiệm của người sử dụng là phải xác lập độ an toàn, bảo đảm sứcrnkhỏe phù hợp với các quy định của quốc gia.

rnrn

QUAN TRỌNG – Điều chủ yếu làrnphép thử theo tiêu chuẩn này cần được tiến hành bởi những nhân viên được tạornphù hợp.

rnrn

1. Phạm vi áprndụng

rnrn

TCVN 6831:2010 (ISO 11348:2007) quyrnđịnh ba phương pháp xác định sự ức chế phát quang của vi khuẩn liền Vibriornfischeri (NRRL B-11177). TCVN 6831-3:2010 (ISO 11348-3) quy định phươngrnpháp sử dụng vi khuẩn đông-khô.

rnrn

Tiêu chuẩn này áp dụng cho:

rnrn

– Nước thải;

rnrn

– Dịch chiết và dịch ngâm chiếtrnbằng nước;

rnrn

– Nước sạch (nước mặt và nướcrnngầm);

rnrn

– Nước biển và nước lợ;

rnrn

– Dịch rửa giải của trầm tích (nướcrnngọt, nước lợ và nước biển)

rnrn

– Nước giếng khoan;

rnrn

– Chất ô nhiễm đơn, được pha loãngrntrong nước.

rnrn

2. Tài liệurnviện dẫn

rnrn

Các tài liệu viện dẫn sau là rấtrncần thiết cho việc áp dụng áp dụng tiêu chuẩn này. Đối với các tài liệu việnrndẫn ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫnrnkhông ghi năm công bố thì áp dụng phiên bản mới nhất bao gồm cả các sửa đổi, bổrnsung (nếu có).

rnrn

TCVN 7325 (ISO 5814), Chất lượngrnnước – Xác định oxy hòa tan – Phương pháp đầu đo điện hóa.

rnrn

ISO 5667-16, Water quality –rnSampling – Part 16: Guidance on biotesting of samples (Chất lượng nước –rnHướng dẫn thử sinh học các mẫu).

rnrn

3. Nguyên tắc

rnrn

Sự ức chế phát quang do cấy virnkhuẩn Vibrio fischeri được xác định bằng cách thử nghiệm theo từng mẻ.rnĐiều đó được thực hiện bằng việc kết hợp các thể tích quy định của mẫu thử hoặcrnmẫu đã pha loãng với huyền phù vi khuẩn phát quang đựng trong ống thử.

rnrn

Chuẩn cứ của phép thử là sự giảm độrnphát quang mẫu thử trong suốt thời gian tiếp xúc, cường độ phát quang trong mẫurnsẽ được đo sau thời gian phản ứng là 15 min và 30 min hoặc có thể đo thêm sau 5rnmin, tùy chọn, có tính đến hệ số hiệu chính ().rnẢnh hưởng ức chế của mẫu nước có thể được xác định bằng LID (xem Phụ lục B)rnhoặc là các giá trị -EC₂₀ và/hoặc giá trị -EC₅₀ thông quarncác dãy pha loãng (EC là nồng độ ảnh hưởng).

rnrn

4 Các chất gâyrnnhiễu

rnrn

Các chất không tan, ít tan hoặc dễrnbay hơi hoặc các chất có phản ứng với nước pha loãng hoặc với huyền phù, hoặcrnlàm thay đổi trạng thái của chúng trong quá trình thử, có thể ảnh hưởng đến kếtrnquả hoặc làm giảm độ tái lập của kết quả thử.

rnrn

Trong trường hợp nước quá đục hoặcrnđậm màu, có thể xảy ra sự dập tắt phát quang do việc hấp thụ ánh sáng hoặc tánrnxạ ánh sáng gây ra. Sự gây nhiễu này đôi khi có thể khắc phục được bằng cách xửrnlý độ đục của mẫu (7.2) hoặc, ví dụ, bằng cách sử dụng cuvet hiệu chính hấp thụrnhai ngăn (xem Phụ lục A).

rnrn

Vì sự phát quang sinh học^[6]rncần đến oxy, nên các mẫu có nhu cầu oxy cao (và/hoặc có nồng độ oxy thấp) córnthể sẽ gây ra sự thiếu hụt oxy và mẫu sẽ bị ức chế.

rnrn

Các chất dinh dưỡng dễ phân hủyrnsinh học trong mẫu có thể làm giảm sự tự ô nhiễm trong việc phát quang sinh học^[1].

rnrn

Mẫu có pH nằm ngoài khoảng từ 6 đếnrn8,5 sẽ ảnh hưởng đến sự phát quang của vi khuẩn ^[6],[7]. Cần phảirnđiều chỉnh pH của mẫu nếu ảnh hưởng độc của pH là không mong muốn.

rnrn

Vì vi khuẩn thử nghiệm Vibriornfishcheri là vi khuẩn biển, nên việc thử nghiệm các mẫu nước mặn theo quy trìnhrnchuẩn thường dẫn đến các hiệu ứng kích thích phát quang sinh học mà có thể chernhiệu ứng ức chế (xem Phụ lục D).

rnrn

Nồng độ muối trong mẫu ban đầu vượtrnquá 30 g/l NaCl, hoặc hàm lượng các thành phần khác có độ thẩm thấu tươngrnđương, cùng với lượng muối cần phải thêm vào khi thử có thể gây gây ra các hiệurnứng siêu thẩm thấu. Để tránh ảnh hưởng này, nồng độ muối cuối cùng có trong mẫurnthử phải không được vượt quá độ thẩm thấu của dung dịch NaCl 35 g/l.

rnrn

5. Thuốc thử vàrncác vật liệu

rnrn

Sử dụng các hóa chất đạt chất lượngrncó cấp phân tích. Dùng nước cất hoặc nước độ tinh khiết tương đương.

rnrn

5.1. Vi khuẩn thử

rnrn

Sử dụng chủng vi khuẩn phát quangrnthuộc loại Vibrio fischeri NRRL – 11177. Các huyền phù vi khuẩn dùng đểrnđo độc tính được chuẩn bị từ các thuốc thử đông – khô có bán sẵn ngoài thịrntrường các thuốc thử này được bảo quản trong tủ lạnh sâu ở nhiệt độ – 18 ^oCrntới – 20 ^oC. Vi khuẩn phát triển ngay sau khi khôi phục và sẵn sàngrnđể dùng cho phép thử.

rnrn

5.2. Dung dịch natri clorua,rnlàm chất pha loãng

rnrn

Hòa tan 20 g natri clorua (NaCl)rntrong nước và thêm nước đến vạch 1 lít.

rnrn

5.3. Dung dịch natri hydroxit,rnví dụ c(NaOH) = 1 mol/l.

rnrn

5.4 Axit clohydric, ví dụ. c(HCl)rn= 1 mol/l.

rnrn

Để điều chỉnh pH có thể cần sử dụngrncác axit hoặc các bazơ nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn.

rnrn

5.5 Dung dịch dùng cho vi khuẩnrnđông – khô

rnrn

20,0 g                              Natrirnclorua (NaCl)

rnrn

2,035 g                            Magiernclorua ngậm sáu nước (MgCl₂.6H₂O)

rnrn

0,30 g                              Kalirnclorua (KCl)

rnrn

Hòa tan các thành phần trên trongrnnước và thêm nước đến vạch 1 lít. Dung dịch này có thể được bảo quản từng phầnrntrong tủ lạnh sâu từ – 18 ^oC tới – 20 ^oC.

rnrn

5.6. Chất chuẩn

rnrn

Chuẩn bị riêng rẽ các dung dịchrnchuẩn gốc, pha loãng bằng dung dịch natri clorua (5.2) mà không cần điều chỉnhrnpH:

rnrn

19,34                               Kẽmrnsunfat ngậm bẩy nước (ZnSO₄.7H₂O)

rnrn

6,8 mg/l                           3,5-dichlorophenolrn(C₆H₄OCl₂) (độ tinh khiết > 99%)

rnrn

105,8 mg/l                        Kalirndicromat (K₂Cr₂O₇)

rnrn

Các nồng độ này xấp xỉ gấp hai lầnrngiá trị các EC₅₀ mong đợi đối với các chất chuẩn tương ứng trongrntiêu chuẩn này. Thể tích yêu cầu phụ thuộc vào yêu cầu thử nghiệm.

rnrn

CHÚ THÍCH Có thể sử dụng các dungrndịch có sẵn ngoài thị trường có nồng độ ZnSO₄ là K₂Cr₂O₇rn(titrisol) xác định để chuẩn bị dung dịch gốc của các chất chuẩn.

rnrn

6. Thiết bị,rndụng cụ

rnrn

6.1. Tủ lạnh sâu, để lưu giữrncác vi khuẩn cần bảo quản.

rnrn

6.2. Tủ ấp hoặc tủ lạnh, đểrnduy trì huyền phù gốc (8.2) và, “dung dịch vi khuẩn đông-khô” (5.5) (biến thểrnB) tùy chọn ở nhiệt độ 4 ^oC ± 3 ^oC.

rnrn

6.3. Hộp kiểm soát nhiệt độ,rnđể duy trì mẫu thử ở nhiệt độ 15 ^oC ± 1^oC. Trong mỗi lầnrnthử nghiệm nhiệt độ chỉ được dao động tối đa ± 0,3 ^oC.

rnrn

6.4. Máy đo độ phát quang,rnngăn đo mẫu được duy trì ở nhiệt độ 15 ^oC ± 1 ^oC, córntrang bị các cuvet phù hợp.

rnrn

6.5. Cuvet thử, làm bằngrnchất liệu trở về hóa học, thích hợp để sử dụng với ngăn đo độ phát quang đãrnchọn và có dung tích tạo thuận lợi để đọc hết bề mặt lớn nhất có thể và phù hợprnvới hộp kiểm soát nhiệt độ (6.3).

rnrn

6.6. pH – mét.

rnrn

6.7. Đồng hồ tính giờ.

rnrn

6.8. Pipet pittông hoặc bơmrntiêm nhựa, 10 ml, 500 ml và 1000 ml.

rnrn

6.9. Pipet pittông dung tíchrncó thể thay đổi, từ 10 ml đến 200 ml và 200 µl đến 5000 µl.

rnrn

6.10. Đầu đo oxy, quy địnhrntrong TCVN 7325 (ISO 5814)

rnrn

7. Lấy mẫu vàrnxử lý sơ bộ mẫu

rnrn

7.1. Lấy mẫu

rnrn

Mẫu phải được đựng trong các vậtrnchứa sạch, trơ về hóa học như quy định trong ISO 5667-16. Nạp đầy mẫu vào vậtrnchứa và gắn kín. Thử nghiệm mẫu càng sớm càng tốt ngay sau khi lấy mẫu. Nếurncần, bảo quản mẫu ở nhiệt độ từ 2 ^oC đến 5 ^oC trong vậtrnchứa ở nơi tối không quá 48 h. Nếu phải bảo quản mẫu đến hai tháng thì để mẫu ởrnnhiệt độ ≤ – 18 ^oC. Không được sử dụng hóa chất để bảo quản mẫu. Cầnrnchỉnh – pH và thêm muối trước khi thử.

rnrn

7.2. Chuẩn bị mẫu

rnrn

Đo nồng độ oxy trong tất cả cácrnmẫu. Nồng độ oxy cần phải > 3 mg/l đối với thử nghiệm này. Nếu nồng độ oxyrncủa mẫu chưa pha loãng nhỏ hơn 3 mg/l, thì phải sử dụng phương pháp làm đủ oxyrncho mẫu, ví dụ sục khí hoặc khuấy.

rnrn

Đo pH của tất cả các mẫu. Nếu pHrnnằm trong khoảng từ 6,0 đến 8,5 thì không cần phải điều chỉnh. Tuy nhiên, việcrnchỉnh giá pH có thể làm biến đổi bản chất của mẫu. Mặt khác, pH của mẫu và pHrncủa mẻ thử có thể khác nhau do khả năng đệm của môi trường thử. Có thể cần phảirnthực hiện thử nghiệm trên cả hai mẫu: mẫu đã điều chỉnh pH và mẫu chưa điềurnchỉnh – pH.

rnrn

Nếu cần, điều chỉnh – Ph của mẫurnbằng cách thêm axit clohydric (5.4) hoặc dung dịch natri hydroxit (5.3). Tùyrnthuộc vào mục đích của phép thử có thể điều chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 hoặc giớirnhạn trên (8,5 ± 0,2) và giới hạn dưới (6,0 ± 0,2). Lựa chọn nồng độ của axitrnclohydric hoặc dung dịch natri hydroxit sao cho thể tích thêm vào không lớn hơnrn5 % tổng thể tích.

rnrn

Cho thêm 20 g natri clorua cho mỗirnlít mẫu nước hoặc vào mẫu nước đã trung hòa.

rnrn

Đối với mẫu có nồng độ muối cao thìrnđo độ muối và nếu cần thêm lượng muối để điều chỉnh độ thẩm thấu tới NaCl 20rng/l.

rnrn

Nếu mẫu chứa từ 20 g/l đến 50 g/lrnNaCl tương đương, không cần thêm muối. Nồng độ muối tạo nên trong mẫu thử khôngrnđược vượt quá độ thẩm thấu 35 g/l dung dịch natri clorua.

rnrn

Đối với những mẫu nước mặn, thamrnkhảo thêm trong Phụ lục D.

rnrn

Các mẫu quá đục cần đục để lắngrntrong 1h hoặc cho ly tâm, ví dụ trong 10 min ở 5000 g hoặc lọc. Sử dụng chấtrnnổi hoặc cái lọc cho phép thử.

rnrn

8. Cách tiếnrnhành

rnrn

8.1. Các bước chuẩn bị ban đầu

rnrn

Chuẩn bị mẫu chuẩn theo 5.6. Phéprnthử theo mẻ đối với sinh vật sau khi thực hiện với cả ba chất chuẩn. Thử ítrnnhất một trong ba chất chuẩn song song với mỗi cuvet dung dịch huyền phù gốc đãrnhoàn nguyên.

rnrn

Chuẩn bị mẫu theo 7.2.

rnrn

Chuẩn bị vào một bộ cuvet thử thứrnnhất (6.5) dãy dung dịch pha loãng mẫu, mẫu so sánh (5.6) và mẫu kiểm tra (5.2)rnyêu cầu.

rnrn

Quy trình thông thường để chuẩn bịrndãy pha loãng được mô tả trong Phụ lục B. Tùy thuộc vào mục đích của thử nghiệmrnvà các yêu cầu thống kê liên quan đến kết quả phép thử, thì các thiết kế dãyrnpha loãng có nồng độ dãy hình học hoặc logarit có thể cũng phù hợp. Vì hỗn hợprncác thể tích bằng nhau của mẫu/mẫu đã pha loãng và huyền phù thử nghiệm, nênrnnồng độ mẫu cao nhất trong phép thử chiếm 50% mẫu thử như là một quy luật. Đốirnvới phép thử mẫu nước gần như không pha loãng (80% mẫu), thì cần thêm mẻ kiểmrntra (xem B.2 và Bảng 1).

rnrn

Duy trì các cuvet thử có chứa dungrndịch natri clorua (5.2) để kiểm soát, mẫu chuẩn (5.6), mẫu (7.2) và các mẫu củarndãy pha loãng (Bảng B.1) ở 15 ^oC ± 1 ^oC.

rnrn

Chọn điều kiện thử nghiệm đảm bảornđộ lệch nhiệt độ tối đa trong bể điều nhiệt trong một phép thử là không quá ±rn0,3 ^oC.

rnrn

8.2. Chuẩn bị huyền phù gốc

rnrn

Chuyển lọ chất cấy đông-khô (hàmrnlượng đủ cho phép đo 100) ra khỏi tủ đá ngay trước khi hoàn nguyên vào nước. Đểrnhoàn nguyên, làm mát 1 ml nước cất trong ống nghiệm thủy tinh ở 4 ^oCrn± 3 ^oC.

rnrn

Rót ngay thể tích nước này đã làmrnmát vào lọ đựng vi khuẩn đã làm khô lạnh, bằng cách đó sẽ giảm thiểu được nhữngrnảnh hưởng tới tế bào, trong suốt quá trình loại nước.

rnrn

Điều quan trọng là phải thêm nướcrnthật nhanh để cho phép vi khuẩn tiếp xúc với nước ngay, do vậy tránh vón cục vàrnmất hoạt tính. Do đó, không nên sử dụng pipet.

rnrn

Huyền phù vi khuẩn phát quang đãrnhoàn nguyên (nồng độ tế bào khoảng 10⁸ tế bào trên mililit) có thểrndùng cho huyền phù gốc; bảo quản huyền phù gốc này ở 4 ^oC ± 3 ^oC.rnSử dụng huyền phù gốc này cho các mục đích thử nghiệm, miễn là khi chuẩn cứ vềrntính đúng đắn nêu trong Điều 11 được thỏa mãn. Chỉ có thể dùng vi khuẩn đã loạirnnước, rã đông cho phép thử sơ bộ.

rnrn

8.3. Chuẩn bị huyền phù thử

rnrn

8.3.1. Bước ban đầu

rnrn

Sau khi chờ ít nhất khoảng 10 min,rnchuẩn bị huyền phù thử từ huyền phù gốc vào bộ cuvet thử thứ hai tương ứngrn(6.5) duy trì ở nhiệt độ 15 ^oC ± 1 ^oC bằng một trong hairnbiến thể.

rnrn

8.3.2 Biến thể A

rnrn

Chuẩn bị các huyền phù thử trựcrntiếp trong ống nghiệm.

rnrn

Thêm 10 ml huyền phù gốc vào 500 mlrndung dịch (5.5), đựng trong các ống nghiệm duy trì ở 15 ^oC ± 1 ^oC,rnở các khoảng thời gian như nhau (5 s đến 20 s) như đối với các phép đo cường độrnsau đây. Lắc các hỗn hợp bằng tay.

rnrn

8.3.3 Biến thể B

rnrn

Chuẩn bị các huyền phù thử trongrnbình nón (ví dụ: dung tích 250 ml) ngoài các ống nghiệm.

rnrn

Thêm 1 thể tích huyền phù gốc vàornthể tích dung dịch (5.5) lớn gấp 50 lần, duy trì ở 4 ^oC ± 3 ^oCrnvà trộn kỹ huyền phù thu được.

rnrn

Dùng pipet lấy 500 ml huyền phù thử cho vào các ống nghiệm, duyrntrì trong tủ ủ ở 15 ^oC ± 1 ^oC, ở các khoảng thời gian (5rns đến 20 s) giống như đối với các phép đo cường độ sau này.

rnrn

CHÚ THÍCH Các lọ vi khuẩn đông-khôrndung tích nhỏ hơn (ví dụ hàm lượng đủ cho mỗi lọ mức đo 20 hoặc 10) có bán sẵnrnngoài thị trường. Vi khuẩn đã khô lạnh trong các lọ này được hoàn nguyên trựcrntiếp bằng cách thêm dung tích vừa đủ của “môi trường vi khuẩn đông-khô” (5.5)rnHuyền phù thử thu được được xử lý như trong biến thể B (8.3.3) bằng cách dùngrnpipet lấy 500 ml dung dịch này cho vàorncác ống nghiệm và duy trì ở nhiệt độ 15 ^oC ± 1 ^oC, trongrnhộp ổn nhiệt.

rnrn

8.4. Quy trình thử

rnrn

Tiến hành phép xác định kép đối vớirnmỗi mức pha loãng ở nhiệt độ thử 15 ^oC ± 1 ^oC.

rnrn

Điều chỉnh dụng cụ đo huỳnh quangrnsao cho thuận tiện và gần với mức cực đại.

rnrn

Sau thời gian ổn định ít nhất 15rnmin, dùng máy đo độ phát quang xác định và ghi cường độ quang, I₀,rncủa các huyền phù thử bằng các giá trị trung bình của độ phát quang.

rnrn

Vì thời gian tiếp xúc đối với tấtrncả các mẫu phải bằng nhau, nên sử dụng đồng hồ bấm giờ (6.7) để đo cường độrnphát quang ở các khoảng thời gian đo bằng nhau. Khoảng thời gian đo thích hợprnlà từ 5 s đến 20 s.

rnrn

Đo tất cả các huyền phù thử, bởi vìrnđộ phát quang có thể khác nhau do huyền phù thử không được đồng nhất.

rnrn

Ngay sau khi đo độ phát quang củarnhuyền phù thử, làm đầy huyền phù thử này tới 1 ml bằng mẫu (7.2), mẫu đã pharnloãng (Phụ lục B), mẫu đối chuẩn (5.6) hoặc dung dịch natri clorua (5.2), khirnthích hợp, thực hiện bằng cách dùng pipet lấy 500 ml mẫu, mẫu pha loãng, mẫu chuẩn hoặc dung dịch natri clorua đãrnchuẩn bị trong dãy cuvet thử thứ nhất, cho vào huyền phù thử cần thử trong mỗirnống nghiệm của dãy cuvet thử thứ hai. Trộn đều bằng tay, bắt đầu bấm giờ và đặtrnống nghiệm trở lại hộp ổn nhiệt tại nhiệt độ 15 ^oC ± 1 ^oC.

rnrn

Lặp lại quy trình trên với tất cảrncác ống nghiệm khác, để cùng khoảng thời gian giữa những lần thêm vào.

rnrn

Đo và ghi cường độ phát quang trongrntất cả các cuvet, kể cả mẫu kiểm tra, cứ sau 15 min và sau 30 min (I₁₅,rnI₃₀), có thể đo sau 5 min (I₅), tùy chọn, đểrnkhoảng thời gian đo từ 5 s đến 20 s.

rnrn

Ghi lại sự điều chỉnh dụng cụ.

rnrn

9. Đánh giá

rnrn

9.1. Ảnh hưởng ức chế lên vi khuẩnrnphát quang

rnrn

Sử dụng Công thức (1) để tính hệ sốrnhiệu chính (giá trị ) từ cường độ phát quang đornđược. Hệ số này dùng để hiệu chính giá trị ban đầu I₀ của tấtrncả các mẫu thử trước khi chúng được dùng làm giá trị chuẩn để xác định độ giảmrnphát quang do nước.

rnrn

 (trn= 5 min, 15 min, 30 min)                            (1)

rnrn

Trong đó

rnrn

 làrnhệ số hiệu chính đối với thời gian tiếp xúc 5 min, 15 min, 30 min;

rnrn

 làrncường độ phát quang trong mẫu kiểm tra sau thời gian tiếp xúc 5 min, 15 minrnhoặc 30 min, tính bằng đơn vị phát quang tương ứng;

rnrn

 làrncường độ phát quang của huyền phù thử kiểm tra, ngay trước khi cho thêm chấtrnpha loãng (5.2), tính bằng đơn vị phát quang tương ứng;

rnrn

Tính hệ số hiệu chính trung bình  và độ chệch của các giá trị riêng từrngiá trị trung bình tính bằng phần trăm, (lấy một chữ số có nghĩa) sử dụng Côngrnthức (2):

rnrn

                                                                         (2)

rnrn

Trong đó:

rnrn

 làrngiá trị riêng của một trong hai hệ số hiệu chính và  làrngiá trị trung bình.

rnrn

Dùng Công thức (3) để tính I_ct:

rnrn

                                     rn(3)

rnrn

Trong đó:

rnrn

 làrngiá trị trung bình của ;

rnrn

 làrncường độ phát quang của huyền phù mẫu thử, ngay trước khi thêm vào mẫu (7.2)rnhoặc mẫu đã pha loãng (Phụ lục B), tính bằng đơn vị phát quang tương ứng;

rnrn

 làrngiá trị đã hiệu chính của I₀ đối với các cuvet đựng mẫu thửrnngay trước khi cho mẫu thử vào.

rnrn

Dùng công thức (4) để tính ảnhrnhưởng ức chế của mẫu thử:

rnrn

                            rn(4)

rnrn

Trong đó

rnrn

H_tlà ảnh hưởngrnức chế của mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 5 min, 15 min hoặc 30 min, tính bằngrnphần trăm;

rnrn

I_ct xem Công thứcrn(3);

rnrn

I_t là cường độrnphát quang của mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 5 min, 15 min hoặc 30 min, tínhrnbằng đơn vị phát quang tương ứng.

rnrn

Tính giá trị trung bình của ảnhrnhưởng ức chế H_t cho mỗi mức pha loãng, tính bằng phần trăm.

rnrn

Tính chênh lệch số học của phép xácrnđịnh song song H_ti từ trung bình tương ứng , tính bằng điểm phần trăm (một chữ sốrncó nghĩa):

rnrn

rnrn

Trong đó:

rnrn

H_ti là một trongrnhai giá trị hiệu ứng ức chế của mẫu thử  làrngiá trị trung bình.

rnrn

Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ,rnước lượng giá trị gamma cho mỗi mức pha loãng sử dụng Công thức (5):

rnrn

                         rn(5)

rnrn

Trong đó

rnrn

 làrngiá trị gamma của mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 5 min 15 min hoặc 30 min;

rnrn

 làrngiá trị trung bình của H_t [xem Công thức (4)].

rnrn

9.2. Xác định các giá trị EC

rnrn

Tính toán mối tương quan ảnh hưởngrncủa nồng độ đối với từng thời gian tiếp xúc sử dụng tuyến tính chuẩn thích hợprnhoặc phân tích hồi quy phi tuyến tính^[8].

rnrn

Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độrnsử dụng kỹ thuật hồi quy tuyến tính, ước lượng giá trị gamma cho từng mức pharnloãng (tỷ lệ của độ giảm phát quang với tổng lượng ánh sáng còn lại tại thờirnđiểm t) sử dụng Công thức (5):

rnrn

                             rn(5)

rnrn

Trong đó:

rnrn

 làrngiá trị gamma của mẫu thử sau thời gian tiếp xúc 5 min 15 min hoặc 30 min;

rnrn

 làrngiá trị trung bình của H_t, [xem Công thức (4)].

rnrn

CHÚ THÍCH Khi một nồng độ thử nhấtrnđịnh cho độ ức chế phát quang sinh học 0% hoặc 100%, thì không thể tính đượcrngiá trị gamma. Do đó, chỉ có những giá trị H_tnằm trongrnkhoảng 10% và 90% được dùng để tính tương quan của nồng độ.

rnrn

Mối tương quan về ảnh hưởng nồng độrntại thời điểm tiếp xúc đã cho thường có thể được mô tả bằng phương trình tuyếnrntính sau:

rnrn

lg c_t = b lgrn + lg a                                  rn(6)

rnrn

Trong đó

rnrn

c_trnlà phần mẫu nước có trong mẫu thử, tính bằng phần trăm;

rnrn

 xem Công thức (5);

rnrn

b là giá trịrncủa độ dốc của đường tuyến tính;

rnrn

lg a là giárntrị của phần bị chắn/giao cắt của đường tuyến tính.

rnrn

Bằng phương pháp thống kê hồi quyrnbình phương tối thiểu chuẩn, tính các giá trị EC₂₀ và EC₅₀rnvới các giới hạn tin cậy tương ứng, trong đó:

rnrn

c_t = EC_20,trnở ;

rnrn

c_t = EC_50,trnở

rnrn

Đối với phân tích hồi quy phi tuyếnrntính, các mô hình khác nhau có sẵn trong phần mềm đồ họa chuẩn hoặc phần mềmrnthống kê. Các phần mềm này được dựa trên hàm phân bố chuẩn (nghĩa là phân tíchrnProbit), phân bố logistic (nghĩa là phân tích Logit), hoặc phân bố Weibullrn(nghĩa là phân tích Weibull). Ảnh hưởng ức chế đã tính (H_t) có thểrnđược dùng trực tiếp để ước lượng thông số ảnh hưởng nồng độ phi tuyến tính, từrnđó, giá trị EC đối với từng mức có thể tính được tiếp sau^[8].

rnrn

Nếu khoảng của cặp giá trị khôngrnkhớp với đường cong, thì các giá trị EC có thể được ước lượng theo hình học sửrndụng hệ thống tọa độ logarit kép.

rnrn

10 Biểu thịrnkết quả

rnrn

Báo cáo kết quả theo mẫu trong Bảngrn1.

rnrn

Bảngrn1 – Ví dụ về đánh giá thử nghiệm – Mẫu: nước thải sau xử lý của trạm xử lý nướcrnthải

rnrn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rnrn

Báo cáo khoảng thời gian thử (5rnmin, 15 min hoặc 30 min).

rnrn

Nếu xác định được, báo cáo giá trịrnLID_lb (xem trong Phụ lục B).

rnrn

Nếu xác định được, báo cáo giá trịrnEC₂₀ và EC₅₀ và phương pháp để tính độ lệch các giá trịrnnày.

rnrn

Báo cáo cách chuẩn bị vi khuẩn đãrnsử dụng.

rnrn

11. Chuẩn cứrnvề tính đúng đắn của phép thử

rnrn

Phép thử được coi là đúng nếu

rnrn

– Giá trị  khirnủ trong 15 min hoặc 30 min nằm trong phạm vi từ 0,6 đến 1,8;

rnrn

– Kết quả của các phép xác địnhrnsong song không chênh lệch so với giá trị trung bình của chúng quá 3% đối vớirncác mẫu kiểm tra;

rnrn

– Đối với các mẫu thử mà xác địnhrngiá trị – LID_lb hoặc giá trị EC₂₀/EC₅₀ tươngrnứng, độ lệch so với giá trị trung bình của chúng “điểm phần trăm” không quá 3%rn(xem Chú thích c trong Bảng 1).

rnrn

– Đối với mẻ vi khuẩn đã rã đông,rncả ba mẫu chuẩn (5.6) (các dung dịch không được trung hòa, kiểm tra riêng rẽ)rngây ức chế từ 20% đến 80% sau thời gian tiếp xúc 30 min ở các nồng độ sau trongrnhuyền phù thử cuối cùng:

rnrn

3,4 mg/l                        3,5-diclorophenol

rnrn

2,2 mg/l                        Zn(II)rn(tương đương 9,67 mg/l kẽm sunfat ngậm bẩy nước)

rnrn

18,7 mg/l                      Crrn(VI) (tương đương 52,9 mg/l kali dicromat)

rnrn

– Một trong ba mẫu chuẩn trên (5.6)rn(dung dịch chưa trung hòa), đã thử trong phép thử song song với mỗi lọ huyềnrnphù gốc đã hoàn nguyên cho phép thử thực tế (8.2) gây ra ức chế 20% đến 80% saurnthời gian tiếp xúc 30 min.

rnrn

12. Độ chínhrnxác

rnrn

Trong chương trình thử nghiệm liênrnphòng cấp quốc gia được tiến hành trong suốt mùa thu năm 1993 do 16 phòng thírnnghiệm tham gia đã xác định các số liệu về độ chính xác. Các kết quả được nêurntrong Phụ lục C.

rnrn

13. Báo cáornthử nghiệm

rnrn

Báo cáo thử nghiệm phải nêu tríchrndẫn của tiêu chuẩn và phần đã sử dụng TCVN 6831:2010 gồm các thông tin sau:

rnrn

a) nhận biết mẫu nước, kể cả việcrnlấy mẫu, thời gian và điều kiện bảo quản;

rnrn

b) pH và nồng độ oxy của mẫu nướcrngốc, tính bằng mg/l hoặc % sự bão hòa của mẫu nước khô;

rnrn

c) ngày thử nghiệm;

rnrn

d) xử lý sơ bộ mẫu, nếu có, ví dụrnpH sau khi điều chỉnh;

rnrn

e) nguồn gốc vi khuẩn, số mẻ; ngàyrnbắt đầu và kết thúc;

rnrn

f) nhiệt độ bảo quản vi khuẩn;

rnrn

g) biểu thị kết quả theo Điều 10 vàrnBảng 1;

rnrn

h) những sai lệch so với phươngrnpháp này và thông tin về các tình huống có thể ảnh hưởng đến kết quả;

rnrn

i) kết quả thử so với chất chuẩnrnđối với mẻ của vi khuẩn và phép thử thực tế.

rnrn

rnrn

Phụ lục A

rnrn

(tham khảo)

rnrn

Phương pháp hiệu chính màu

rnrn

A.1. Phạm vi áp dụng

rnrn

Việc giảm độ phát quang do hấp thụrnánh sáng có thể xảy ra khi mẫu trong các dãy pha loãng quan sát thấy rõ màu,rnđặc biệt những màu từ đỏ đến nâu. Nếu quan sát thấy màu ở nồng độ EC₂₀,rnthì nên thực hiện quy trình sau đây để kiểm tra nếu cần phải hiệu chính màu.rnTrong mọi trường hợp, khi nồng độ của mẫu thử gần với giá trị – EC₅₀rnthì nên hiệu chính màu.

rnrn

A.2. Dụng cụ bổ sung

rnrn

A.2.1. Cuvet hiệu chính – màu:rncuvet-hai lớp, lắp vừa với máy đo độ phát quang.

rnrn

A.2.2. Pipet Pasteur.

rnrn

A.3. Cách tiến hành

rnrn

Thực hiện toàn bộ quy trình hiệurnchính màu ở nhiệt độ 15 ^oC ± 1 ^oC trong tủ ủ kiểm soátrnđược nhiệt độ.

rnrn

Chuẩn bị một dung dịch pha loãngrnmẫu thử (5.2) có nồng độ gần giá trị EC_20,t (C_k). Nếu giárntrị-EC_20,t chênh lệch nhiều thì C_k phải gần với giá trịrnEC_20,t thấp hơn.

rnrn

CHÚ THÍCH – Không cần phải chọn C_krnkhác nhau cho mỗi khoảng thời gian tiếp xúc (5 min, 15 min, 30 min).

rnrn

Cho 2,0 ml dung dịch natri cloruarn2% (5.2) vào khoang ngoài của cuvet hiệu chính – màu.

rnrn

Chuẩn bị huyền phù vi khuẩn đặcrnbiệt.

rnrn

Chuẩn bị vi khuẩn đông-khô theorn8.2, sử dụng 1,0 ml nước pha loãng với 50 mlrnhuyền phù vi khuẩn gốc.

rnrn

Trộn kỹ huyền phù trước khi dùngrnpipet Paster để chuyển vào khoang trong của cuvet hiệu chính màu. Thêm huyềnrnphù cho bằng với mức dung dịch có trong khoang ngoài của cuvet hiệu chính màu.rnĐo mức ánh sáng (B₀) sau ít nhất 15 min, và bật đồng hồ bấm giờ.

rnrn

Từ thời điểm này trở đi, vị trí củarncuvet hiệu chính màu trong khoảng đo phải được giữ nguyên cho tất cả các sốrnđọc.

rnrn

Dùng pipet lấy hết dung dịch natrirnclorua từ khoang ngoài và thay vào đó bằng 2,0 ml mẫu thử đã pha loãng (Phụ lụcrnB) và làm lạnh trước đến 15 ^oC ± 1 ^oC.

rnrn

Đo mức ánh sáng (I₅)rn5 min sau lần đo đầu.

rnrn

Dùng pipet lấy hết mẫu thử đã pharnloãng từ khoang ngoài và thay vào đó bằng 2,0 ml dung dịch natri clorua.

rnrn

Đo mức ánh sáng (B₁₀)rn10 min sau lần đo đầu.

rnrn

CHÚ THÍCH 2 Quy trình này có thểrnđơn giản hóa bằng cách dùng hai ống hiệu chính màu giống hệt nhau. Khoang ngoàirncủa ống thứ nhất chứa đầy nước, khoang ngoài cả cuvet thứ hai chứa đầy mẫu đãrnpha loãng. Sau 15 min, có thể đo mức ánh sáng B₀ và I₀.rnNhững giá trị này khi đó có thể thay cho những giá trị B₅ và I₅rnđể tính toán trong A.4.

rnrn

A.4. Tính toán kết quả

rnrn

Các tính toán thừa nhận rằng cườngrnđộ màu của mẫu phù hợp với định luật Beer-Lambert, đó là trường hợp thôngrnthường.

rnrn

Tính B₅ theo côngrnthức (A.1):

rnrn

rnrn

(A.1)

rnrn

Tính độ hấp thụ (A_t)rncủa nồng độ EC_20,t chưa hiệu chính với thời điểm tiếp xúc (t)rntheo Công thức (A.2):

rnrn

                                                                        (A.2)

rnrn

Trong đó

rnrn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rnrn

Tính độ truyền qua tương ứng (T_t)rntheo Công thức (A.3):

rnrn

rnrn

(A.3)

rnrn

Tính những giá trị gamma đã hiệurnchính () theo Công thức (A.4):

rnrn

rnrn

(A.4)

rnrn

và theo Công thức (A.5):

rnrn

rnrn

(A.5)

rnrn

Trong đó

rnrn

 làrnhệ số hiệu chính cho giá trị gamma ở thời điểm tiếp xúc đã định (t);

rnrn

 làrngiá trị gamma gốc.

rnrn

Tiến hành tính lại kết quả thử vớirngiá trị đã được hiệu chính.

rnrn

Với thời gian tiếp xúc đã định, córnthể tính được độ hấp thụ (A_t) và độ truyền qua (T_t) đốirnvới mỗi nồng độ thử, và từ đó tính được giá trị gamma chưa hiệu chính theo Côngrnthức (A.6):

rnrn

rnrn

(A.6)

rnrn

Hệ số hiệu chính là giống nhau đốirnvới mỗi giá trị gamma, khi thừa nhận độ dốc của đồ thị gốc là đúng. Do đó, điềurnnày đủ để tính hệ số hiệu chính chỉ đối với một giá trị gamma. Trong phép xácrnđịnh này, áp dụng giá trị gamma tương ứng với nồng độ EC_20,t chưarnhiệu chính (). Công thức (A.7) tính hệ số hiệurnchính được rút gọn như sau:

rnrn

rnrn

(A.7)

rnrn

Trong đó

rnrn

T_tlà giá trịrnphát quang sinh học đo được ở thời điểm tiếp xúc đã định (t);

rnrn

 làrnhệ số hiệu chính cho các giá trị gamma ở thời điểm tiếp xúc đã định (t);

rnrn

 làrngiá trị gamma gốc;

rnrn

 làrngiá trị gamma đã được hiệu chính.

rnrn

A.5. Ví dụ

rnrn

BảngrnA.1 – Ví dụ

rnrn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rnrn

rnrn

Phụ lục B

rnrn

(tham khảo)

rnrn

Mức pha loãng D – Chuẩn bị các dãy pharnloãng

rnrn

B.1. Nguyên tắc

rnrn

Khi thử nước thải bằng cách pharnloãng dần (D) mẻ thứ có nồng độ đậm đặc nhất mà ở nồng độ này không có ức chế,rnhoặc chỉ có ít ảnh hưởng ức chế mà không vượt quá độ biến đổi đặc trưng thửrnnghiệm, được gọi là “Độ pha loãng không ảnh hưởng thấp nhất (LID)”. Độ pharnloãng này được biểu thị bằng giá trị nghịch đảo của phần thể tích nước thảirntrong mẻ thử [ví dụ, nếu hàm lượng nước thải là 1 trong 4 (25% phần thể tích)rnthì mức pha loãng là D = 4].

rnrn

Trong phép thử vi khuẩn phát quang,rnthường trộn các thể tích huyền phù thử đúng bằng với thể tích của mẫu nước hoặcrnthể tích của mẫu đã pha loãng. Do đó, các mức pha loãng trong các dãy pha loãngrntheo thông lệ là D ≥ 2 (nồng độ mẫu cao nhất trong phép thử: 50% mẫu).

rnrn

B.2. Chuẩn bị mẫu

rnrn

Chuẩn bị mẫu theo 7.2.

rnrn

Mẫu nước thải phải đồng nhất bằngrncách lắc nhẹ bằng tay hoặc trộn bằng khuấy từ.

rnrn

Thêm 20 g dung dịch natri cloruarnvào mỗi lít mẫu nước hoặc mẫu nước đã điều chỉnh – pH. Đối với mẫu nước có nồngrnđộ muối cao, đo độ muối và tinh lượng NaCl (nếu cần) cần để điều chỉnh độ thẩmrnthấu. Nồng độ muối thu được trong mẫu thử không được vượt quá độ thẩm thấu củarndung dịch natri clorua 35 g/l.

rnrn

Chuẩn bị dãy pha loãng trong dãyrncuvet thử thứ nhất. Nên dùng dãy pha loãng theo Bảng B.1. Dãy pha loãng đượcrnchuẩn bị bằng cách pha loãng dần và kết hợp hai pha loãng hình học (D = 2, 4,rn8, 16,…. và D = 3, 6, 12, 24,…). Đối với các phép xác định song song, thể tíchrnmẫu hoặc mẫu đã pha loãng hoặc mẫu kiểm tra bằng 1 500 ml là đủ.

rnrn

BảngrnB.1 – Chuẩn bị dãy pha loãng

rnrn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rnrn

Cách dễ nhất để chuẩn bị dãy pharnloãng này là tạo hai dung dịch pha loãng gốc trong các ống nghiệm riêng rẽ (xemrnHình B.1).

rnrn

rnrn

CHÚ DẪN

rnrn

1 mẫu

rnrn

^a Mẫu pha loãng để tạorndãy thử thứ nhất.

rnrn

^b Mức pha loãng cuốirncùng D sau khi thêm huyền phù thử.

rnrn

HìnhrnB.1 – Sơ đồ pha loãng

rnrn

Pha loãng 1 trong 1, 3 000 ml mẫu chưa pha loãng (độ pha loãng cuối cùngrntrong phép thử sau khi trộn với các thể tích bằng nhau huyền phù thử sẽ là 1rntrong 2).

rnrn

Pha loãng 2 trong 3, ví dụ 2 000 ml mẫu + 1 000 mlrndung dịch 5.2 (độ pha loãng cuối cùng trong phép thử sau khi trộn với các thểrntích huyền phù thử bằng nhau sẽ là 1 trong 3).

rnrn

Đối với những chuẩn bị pha loãngrnhơn nữa, chuyển 1 500 ml mẫu/mẫu đã pharnloãng vào 1 500 ml dung dịch 5.2 trongrncác ống thử, trộn đều sau từng lần chuyển.

rnrn

Trong phép thử vi khuẩn phát quang,rnthường 500 ml mẫu nước hoặc mẫu đã pharnloãng được chuẩn bị trong dãy thử thứ nhất được trộn với huyền phù thử (8.3)rnđược chuẩn bị trong dãy ống thử thứ hai, sau khi đo cường độ ánh sáng ban đầurncủa huyền phù thử. Do vậy, mức pha loãng thu được D trong mẻ thử đối với phéprnđo sự ức chế phát quang là gấp đôi độ pha loãng của mẫu đã pha loãng.

rnrn

Nếu cần thử mẫu nước gần như chưarnpha loãng, có thể thêm 800 ml mẫu nướcrnchưa pha loãng (7.2) vào 200 ml huyềnrnphù thử. Độ pha loãng của mẫu là 1 trong 1,25 (nồng độ mẫu cuối cùng trong phéprnthử: 80 % mẫu). Giá trị D tương ứng có thể được coi là như D = 1. Chọn biến thểrnA (8.3.2) để chuẩn bị huyền phù thử. Đối với giá trị này, cần có một mẻ kiểmrntra thêm để tính toán hệ số hiệu chính phục vụ cho việc hiệu chính giá trị banrnđầu. Mẻ kiểm tra được làm bằng cách thêm 800 mlrndung dịch natri clorua (5.2) vào 200 mlrnhuyền phù thử.

rnrn

B.3. Cách tiến hành

rnrn

Thực hiện phép thử theo 8.3

rnrn

Thực hiện phép xác định kép đối vớirntừng mức pha loãng.

rnrn

Xác định và ghi lại cường độ phátrnquang trong tất cả các ống thử, kể cả ống thử kiểm tra, sau 15 min và 30 min (I₃₀),rntùy chọn.

rnrn

B.4. Đánh giá

rnrn

Tính giá trị trung bình của ảnhrnhưởng ức chế  đối với từng mức pha loãng, tính bằngrnphần trăm (xem 9.1).

rnrn

Tính độ lệch của phép xác định songrnsong  so với giá trị trung bình của chúngrntương ứng cho phép xác định kép H₃₀ (%) (trung bình) – H₃₀rn(%) tính bằng điểm phần trăm, (một chữ số có nghĩa) và theo phần trăm củarntrung bình cho kiểm tra. (hệ số điều chỉnh, xem 9.1).

rnrn

B.5. Thể hiện kết quả

rnrn

Tính đúng của kết quả theo Điều 10

rnrn

Giá trị D thấp nhất được thử tạirnmức mà hiệu ứng ức chế trung bình  là < 20%, đượcrngọi là LID_lb.

rnrn

B.6. Báo cáo phép thử

rnrn

Xem Điều 13.

rnrn

Ngoài các số liệu được yêu cầurntrong tiêu chuẩn này, báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thông tin về độ trong củarnnước thải, điều chỉnh độ muối và phương pháp xử lý sơ bộ (lắng, lọc, ly tâm,rnsục khí).

rnrn

rnrn

Phụ lục C

rnrn

(tham khảo)

rnrn

Số liệu độ đúng

rnrn

Đối với chương trình thử nghiệmrnliên phòng, dung dịch chưa trung hòa gồm 3,5-diclorophenol, kẽm sunfat ngậm bảyrnnước, kali dicromat và xetyltrimethyammonium bromua được pha bằng nước cất hoặcrnnước có độ tinh khiết tương đương. Những giá trị EC được xác định như nêu trongrn9.2, và các kết quả được đưa ra trong Bảng C.1.

rnrn

CHÚ THÍCH Do một số phòng thírnnghiệm cho kết quả ức chế lớn hơn 20% ở nồng độ thử thấp nhất hoặc kết quả ứcrnchế nhỏ hơn 50% ở nồng độ thử cao nhất nên các giá trị I đôi khi có sựrnkhác nhau đối với EC₂₀ và EC₅₀.

rnrn

BảngrnC.1 – Số liệu về độ chính xác đối với vi khuẩn đông – khô

rnrn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rnrn

rnrn

Phụ lục D

rnrn

(tham khảo)

rnrn

Thử mẫu nước mặn với phép thử vi khuẩn phátrnquang dùng vi khuẩn đông – khô

rnrn

D.1. Thông tin chung

rnrn

Vi khuẩn thử Vibrio fischeri làrnvi khuẩn biển. Thử mẫu nước mặn bằng quy trình chuẩn thường dẫn tới những ảnhrnhưởng kích thích mà có thể gây cản trở những hiệu ứng ức chế^[2]. Sựrnkích thích đó có thể do các ion của kim loại kiềm và kim loại kiềm thổ ^[2],[3].rnVới những cải biến này của quy trình thử, sự phát quang sinh học trong kiểm trarnđược tối ưu bằng cách sử dụng nước biển nhân tạo hoặc nước lợ nhân tạo khi kiểmrntra và pha loãng. Do vậy, những hiệu ứng kích thích được giảm bớt và phươngrnpháp này có thể áp dụng cho mẫu nước biển, nước lợ và nước lọc tương ứng.

rnrn

D.2. Định nghĩa

rnrn

D.2.1. Độ muối (Salinity)

rnrn

Độ muối thực tế (practicalrnsanility)

rnrn

S

rnrn

Đại lượng không thứ nguyên, dùng đểrnkiểm tra chất lượng nước, được xem như sự ước lượng về nồng độ của muối hòa tanrntrong nước biển, tính bằng gam trên kilogram; Điều này cũng được định nghĩarntheo toán học, là tỷ số (K₁₅) giữa độ dẫn điện của mẫu nước, tại 15 ^oCrnvà 1atm*,rnvà độ dẫn điện của dung dịch kali clorua xác định (32,4366 g/kg mẫu) ở cùngrnnhiệt độ và áp suất.

rnrn

CHÚ THÍCH Chấp nhận từ TCVNrn8184-2:2009 (ISO 6107-2:2006), định nghĩa 85.

rnrn

D.2.2. Mẫu nước mặn (saltrnwater sample)

rnrn

Mẫu nước mặn hoặc lợ có độ muốirntrong khoảng từ 5 đến 35.

rnrn

D.2.3. Nước chiết của trầm tíchrnbiển hoặc lợ (Eluates of marine or brackish sediments).

rnrn

Dịch chiết lỏng của trầm tích biểnrnhoặc nước lợ có nước lợ/biển nhân tạo hoặc tự nhiên như môi trường rửa giải.

rnrn

D.2.4 Trầm tích nước biển hoặcrnnước lợ (Pore water of marine or brackish sediment particles)

rnrn

Nước nằm giữa các hạt trầm tíchrnbiển và trầm tích lợ.

rnrn

D.3. Vật liệu

rnrn

D.3.1. Chất chuẩn

rnrn

– 3,5-dichlorophenol;

rnrn

– Kẽm sunfat ngậm bảy nước (ZnSO₄.7H₂O).

rnrn

D.3.2 Nước biển nhân tạo (ASW)rnvà nước lợ nhân tạo (ABW)

rnrn

Sử dụng nước đã loại ion để chuẩnrnbị nước biển nhân tạo (ASW) và nước lợ nhân tạo (ABW) với các thành phần đượcrnnêu trong Bảng D.1. Tất cả thuốc thử phải ở cấp độ tinh khiết.

rnrn

BảngrnD.1 – Nước biển nhân tạo (ASW) (như quy định trong ISO 10253^[5]) vàrnnước lợ nhân tạo (ABW)

rnrn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rnrn

D.4. Cách tiến hành

rnrn

D.4.1. Khái quát

rnrn

Hoàn nguyên vi khuẩn theo một quy trìnhrnchuẩn. Tùy thuộc vào độ muối của mẫu, sử dụng nước biển nhân tạo (ASW) hoặcrnnước lợ nhân tạo (ABW) (D.3.2) làm mẫu kiểm tra âm, nước pha loãng cho dãy pharnloãng mẫu và nước pha loãng cho chất chuẩn thay cho dung dịch natri clorua 2% (Srn20) (xem thông tóm tắt trong Bảng D.2).

rnrn

Bảngrn– D.2 So sánh quy trình chuẩn và quy trình cải biến

rnrn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rnrn

D.4.2 Mẫu với độ muối 5 ≤ x ≤ 20rn(nước lợ cải biến)

rnrn

Đo và lập tài liệu về độ muối củarnmẫu. Mẫu có độ muối S < 20 thì cần phải tăng độ muối lên S = 20 bằng natrirnclorua. Đo giá trị pH của mẫu. Nếu pH nằm trong khoảng 7,0 đến 8,5, thì sự điềurnchỉnh là không cần thiết. Nếu cần, điều chỉnh pH của mẫu tới 7,5 ± 0,2 bằngrncách thêm axit clohydric hoặc dung dịch natri hydroxit; Chọn nồng độ của axitrnclohydric hoặc dung dịch natri hydroxit để hạn chế thể tích thêm vào không quárn5% tổng thể tích.

rnrn

Sử dụng nước lợ nhân tạo (ABW)rn(D.3.2)

rnrn

– Làm mẫu kiểm tra,

rnrn

– Dùng cho dãy pha loãng của mẫu,

rnrn

– Dùng cho dung dịch gốc của chấtrnchuẩn cũng và cho dây pha loãng của dung dịch gốc.

rnrn

D.4.3. Mẫu có độ muối 20 < xrn≤ 35 (nước biển cải biến)

rnrn

Đo và lập tài liệu về độ muối củarnmẫu. Đo giá trị pH của mẫu. Nếu pH nằm trong khoảng từ 7,0 đến 8,0 thì sự điềurnchỉnh thường là không cần thiết. Nếu cần, điều chỉnh pH của mẫu tới 7,4 ± 0,2rnbằng cách thêm axit clohydric hoặc dung dịch natri hydroxit; chọn nồng độ củarnaxit clohdyric hoặc dung dịch natri hydroxit để hạn chế thể tích thêm vào khôngrnquá 5% tổng thể tích.

rnrn

Sử dụng nước biển nhân tạo (ASW)rn(D.3.2)

rnrn

– Làm mẫu kiểm tra,

rnrn

– Dùng cho dãy pha loãng của mẫu,

rnrn

– Dùng cho dung dịch gốc của chấtrnchuẩn cũng và cho dãy pha loãng của dung dịch gốc.

rnrn

D.5. Số liệu độ đúng

rnrn

Giá trị EC₅₀ trong bảngrnD.3 xác định được trong phòng thí nghiệm đối với chất chuẩn 3,5-dichlorophenolrn(D.3.1). Các tài liệu liên quan tới kẽm sunfat ngậm bẩy nước thì bị giới hạn vàrnkhông thu được kết quả trong các thử nghiệm tại phòng thí nghiệm. Chỉ được thểrnhiện dưới dạng thông tin bắt buộc.

rnrn

CHÚ THÍCH Ngoại lệ không tính đếnrnđộ lệch của giá trị trung bình và nhược điểm dữ liệu của quy trình chuẩn trongrnquy trình chuyển đổi.

rnrn

BảngrnD.3 – Số liệu đúng với vi khuẩn đông – khô

rnrn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rnrn

rnrn

THƯrnMỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO

rnrn

[1] TCVN 8184-2:2009 (ISO 6107-2:2006),rnChất lượng nước – Thuật ngữ – Phần 2

rnrn

[2] ISO/TS 20281, Water qualityrn– Guidance on statistical interpretation of ecotoxicity data

rnrn

[3] ISO 10253, Water quality –rnMarine algal growth inhibition test with Skeletonema costatum andrnPhaeodactylum tricornutum (Chất lượng nước – Thử ức chế phát triển của tảornbiển bằng Skeletonema costaum và Phaeodactylum tricomutum)

rnrn

[4] GRABERT, E., KOSSLER, F. Aboutrnthe nutrients on the luminescent bacteria test (Về chất dinh dưỡng trong phéprnthử vi khuẩn phát quang). In: Hastings J.W., Kricka L.J., Stanley P.E.,rneditors. Bioluminescence and Chemiluminescence, Molecular Reporting withrnPhotons. Chichester: John Wiley & Sons Ltd, 1996, pp. 291-294

rnrn

[5] KLEIN, B. (1992): Die Rolle desrnKaliums bei Toxizitatstests mit Leuchtbakterien (incl. abstract in English: Thernrole of potassium in toxicity tests using luminescent bacteria). Z.f.Angew.Zool.,rnVol.4, pp.199-219

rnrn

[6] KREBS, F. (1992):rnGewasseruntersuchung mit durch Alkali – und Erdalkalionen – Zugabe optimiertenrnDIN-Leuchtbakterientest, dargestellt am Beispiel der Saar (incl. abstract inrnEnglish: River water analysis with luminescent bacteria test according tornDIN, optimized by the addition of alkaline and alkaline-earth ions, with thernRiver Saar as an exsample (Phân tích nước sông bằng phép thử vi khuẩn phátrnquang theo DIN, bằng cách thêm các ion kiềm và kiềm thổ, lấy ví dụ nước sôngrnSaar)) In: Steinhauser, K.G. & Hansen, P.D. (Eds). BiologischernTestverfahren. Stuttgart. Germany. Gustav Fischer Verlag. Schr.-Reihe VereinrnWaBolu. Pp. 657-673.

rnrn

[7] POSTMA, J.F. et al (2002).rnConfounding factors in bioassays with freshwater and marine organisms. Ecotoxicol.rnEnviron. Safety, 53 (2), pp. 226-237

rnrn

[8] KREBS, F. (1993).rnToxizitatstest mit gefriergettrockneten Leuchtbakterien. Gewasserschutz, Water,rnAbwasser, 63, pp.173-230.

rnrn