Tiêu chuẩn ngành 10TCN 836:2006 về thức ăn chăn nuôi – xác định hàm lượng tylosin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành

TIÊU CHUẨN NGÀNH

rnrn

10TCN 836:2006

rnrn

THỨCrnĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG TYLOSIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆUrnNĂNG CAO

rnrn

Animalrnfeeding stuffs – Determination of content of tylosin by high – performancernliquid chromatographic method

rnrn

(Ban hành kèm theo Quyếtrnđịnh số 4099/QĐ/BNN-KHCN ngày 29 tháng 12 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nông nghiệprnvà Phát triển nông thôn)

rnrn

1. Phạm vi áp dụng

rnrn

Tiêu chuẩn này áp dụng để phân tích hàm lượng kháng sinhrntylosin trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng caorn(HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,12mg/kg.

rnrn

2. Tài liệu viện dẫn

rnrn

Các tài liệu viện dẫn sau đây rất cần thiết cho việc áprndụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụngrnphiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áprndụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi:

rnrn

TCVN 4851 (ISO 3696). Nước dùng để phân tích trong phòngrnthí nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

rnrn

ISO 6497:2002 (E). Animal feeding stuffs – Sampling.

rnrn

3.rnNguyên tắc

rnrn

Tylosin trong mẫu thức ăn chăn nuôi được chiết bằngrnmetanol. Dịch chiết được làm sạch bằng cột SPE cyano-propyl và cột nhôm oxit,rnsau đó tylosin được tách và định lượng trên hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng caornvới detector UV ở bước sóng 280nm.

rnrn

4.rnThiết bị, dụng cụ

rnrn

4.1. Máy nghiền mẫu phòng thí nghiệm.

rnrn

4.2. Sàng phòng thí nghiệm, có kích thước lỗ sàng 1,00 mmrnvà 3,00 mm.

rnrn

4.3. Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g.

rnrn

4.4. Cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01 g.

rnrn

4.5. Máy ly tâm lạnhrncó tốc độ 2000 – 4000 vòng/phút, sử dụng ống ly tâm dung tích 50 ml.

rnrn

4.6. ống ly tâm, dung tích 50 ml bằng polypropylen hoặcrnbằng thuỷ tinh, có nắp đậy.

rnrn

4.7. Máy nghiền đồng thể (Homogenizer).

rnrn

4.8. Máy lắc tròn hoặc máy lắc ngang có thể đạt tốc độrn250 vòng/phút.

rnrn

4.9. Máy đo pH có độ chính xác đến 0,05 đơn vị.

rnrn

4.10. Bình định mức dung tích 10, 25, 100, 1000 ml.

rnrn

4.11. Pipet tự động điều chỉnh được từ  1ml đến 10 ml.

rnrn

4.12. Micropipet dung tích từ 10 ml đến 100 ml.

rnrn

4.13. Hút dung môi tự động 2 ml, 10 ml, 20 ml.

rnrn

4.14. Máy lắc ống nghiệm (Vortex mixer).

rnrn

4.15. Syranh nhựa 1ml.

rnrn

4.16. Cột chiết pha rắn cycano-propyl, 6ml, 500 mg.

rnrn

4.17. Bình chiết pha rắn (SPE).

rnrn

4.18. Bể siêu âm.

rnrn

4.19. Bơm  hút chân không.

rnrn

4.20. Màng lọc syranh có kích thước 0,45 mm.

rnrn

4.21. Lọ nhỏ dựng dịch mẫu chuyên dụng cho HPLC, có nắprnvặn PTFE .

rnrn

4.22. Thiết bị trộn mẫu phòng thí nghiệm loại HobartrnModel C 100 T hoặc tương đương.

rnrn

4.23. Thiết bị chia mẫu:

rnrn

Thiết bị chia đôirnhoặc chia tư mẫu: ví dụ như thiết bị chia tư hình nón, thiết bị chia nhiều ngănrncó hệ thống phân hạt hoặc các thiết bị chia khác đảm bảo phân chia mẫu thírnnghiệm thành mẫu thử đồng nhất

rnrn

4.24. Hộp đựng mẫu córnnắp kín.

rnrn

4.25.  Hệ thống HPLC gồm có:

rnrn

4.25.1. Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao, bình chứa dungrnmôi, hệ thống bơm mẫu, detector UV đặt được ở bước sóng 350nm, máy ghi hoặc bộrntích phân.

rnrn

4.25.2. Cột phân tích HPLC pha đảo có kèm cột bảo vệ

rnrn

            Chiều dài                         250mm

rnrn

            Đường kính trong            4,6mm

rnrn

            Hạt nhồi                           C 18, 5mm hoặc tương đương

rnrn

CHÚ Ý: có thể sử dụng cột ngắn hơn, ví dụ có chiều dàirn120mm-150mm

rnrn

5. Hóa chất và thuốc thử

rnrn

5.1. Hoá chất

rnrn

Chỉ sử dụng hoá chất được công nhận đạt chất lượng tinhrnkhiết phân tích và nước cất cấp hạng 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696). Các dung môirnphải đạt chất lượng để dùng cho phân tích HPLC.

rnrn

5.1.1. Nhôm oxit 90, hoạt hoá.

rnrn

5.1.2. Acetonitrile.

rnrn

5.1.3. Diethylamine

rnrn

5.1.4. N-hexan.

rnrn

5.1.5. Metanol.

rnrn

5.1.6. Acid phosphoric (85%).

rnrn

5.1.7. Acid clohydric.

rnrn

5.1.8. Natri acetat.

rnrn

5.1.9. Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄).

rnrn

5.1.10. Kali hydrophosphat (K₂HPO₄).

rnrn

5.1.11. Natri hydrophosphat ngậm 2 phân tử nước (Na₂HPO₄.2H₂O).

rnrn

5.1.12. Chất chuẩn tylosin: loại tinh khiết, có kèm theorngiấy chứng nhận hàm lượng.

rnrn

5.2. Thuốc thử

rnrn

5.2.1. Dung dịch đệm acetat 0,15M, pH 5,5

rnrn

Cân 12,30 g natri acetate vào ống đong 1000ml. Thêm 900rnml nước cất đến khi hòa tan hết. Điều chỉnh pH đến 5,5 bằng dung dịch axitrnclohydric 1N. Thêm nước đến 1000 ml.

rnrn

5.2.2. Dung dịch đệm phosphat 0,06M, pH 8,0

rnrn

Hòa tan 9,08 g kali dihydrophosphat bằng nước cất vàornbình định mức 1000ml và thêm nước cất đến vạch mức, trộn đều (dung dịch I).

rnrn

Hòa tan 11,88 g natri hydrophosphat ngậm 2 phân tử nướcrnbằng nước cất vào bình định mức 1000ml và thêm nước cất đến vạch mức, trộn đềurn(dung dịch II).

rnrn

Trộn 5,5 ml dung dịch I và 94,5 ml dung dịch II để đượcrn100 ml dung dịch đệm phosphat 0,06 M, pH 8,0.

rnrn

5.2.3. Pha động A

rnrn

Hòa tan 8,71 g kali dihydrophosphat bằng 900 ml nước cất.rnĐiều chỉnh pH đến 2,5 bằng dung dịch acid phosphoric 85%. Thêm nước vừa đủ 1000rnml. Pha động A được chuẩn bị bằng cách trộn dung dịch này với acetonitrile theorntỷ lệ thể tích 80:20. Sau đó lọc hỗn hợp dung dịch thu được qua phễu hút chânrnkhông với màng lọc có kích thước lỗ 0,45 mm,rnsiêu âm đuổi khí ở nhiệt độ thường trong 30 phút.

rnrn

5.2.4. Dung dịch chuẩn

rnrn

5.2.4.1. Dung dịch chuẩn gốc 1000mg/ml: Cân 28,25 mg chính xác đến 0,1mgrnchất chuẩn tylosin vào bình định mức 25ml (lượng cân được điều chỉnh theo hàmrnlượng tylosin ghi trong giấy chứng nhận), hòa tan và định mức bằng metanol. Cácrndung dịch chuẩn gốc bảo quản ở 4⁰C có thể sử dụng được trong vòng 1rntháng.

rnrn

5.2.4.2. Dung dịch chuẩn làm việc 10mg/ml: Lấy 0,1ml dung dịch chuẩn gốcrn(5.2.4.1) vào bình định mức 10ml, định mức tới vạch bằng metanol, lắc đều đểrnđược các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ tương ứng là 10mg/ml. Pha dung dịch chuẩn làm việcrntrước khi phân tích mẫu.

rnrn

5.2.4.3. Dãy dung dịch chuẩn phân tích sắc ký: 0,625;rn1,250; 2,50; và 5,00 mg/ml

rnrn

Pha loãng dung dịch chuẩn làm việc 10mg/ml (5.2.4.2) bằng cách pha loãng vớirnmetanol (tỉ lệ thể tích 1:1) vào bình định mức dung tích 10 ml để được các dungrndịch có nồng độ tương ứng là 5,00; 2,50; 1,25; 0,625 mg/ ml. Bảo quản dung dịch trong tủrnlạnh, dung dịch này bền trong 1 tuần.

rnrn

5.2.4.4. Cột nhồi nhôm oxit:

rnrn

Chuẩn bị cột làm sạch bằng như sau: hoạt hóa nhôm oxit ởrn500^o C trong 12 giờ. Để nguội và bảo quản trong bình hút ẩm. Lót mộtrnlớp bông thủy tinh vào syranh nhựa 1ml (4.9), nhồi 0,5ml nhôm oxit, lót lớprntrên bằng một ít bông thủy tinh. Cột được chuẩn bị khi tiến hành làm sạch mẫurn(7.4). 

rnrn

6. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

rnrn

6.1. Lấy mẫu

rnrn

Phương pháp lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này,rnnên lấy mẫu theo ISO 6497:2002. Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thí nghiệmrnphải là mẫu trung thực và có tính đại diện, không bị hư hại hoặc bị biến đổirnthành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Khối lượng mẫu phân tíchrnphải không được ít hơn 500 gam.

rnrn

6.2. Chuẩn bị mẫu

rnrn

6.2.1. Mẫu ở dạng bột mịn

rnrn

Nếu mẫu thí nghiệm ở dạng bột lọt hoàn toàn qua sàng córnkích thước lỗ sàng 1,00 mm thì trộn thật đều mẫu (500 gam) bằng máy trộn phòngrnthí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút. Sau đó chia hỗnrnhợp bằng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư cho đến khi thu được lượng mẫurnthử không dưới 100 gam. Cho toàn bộ mẫu thử vào hộp đựng mẫu và đậy nắp cẩnrnthận.

rnrn

6.2.2. Mẫu có kích thước hạt vừa

rnrn

6.2.2.1. Nếu mẫu thí nghiệm không lọt hết qua sàng córnkích thước lỗ sàng 1,00 mm nhưng lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ 3,00rnmm thì trộn thật đều mẫu (không ít hơn 500 gam)  bằng máy trộn phòng thí nghiệmrnloại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút.

rnrn

6.2.2.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫurnđã trộn đều (6.2.2.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam.rnNghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máyrnnghiền (4.1) cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00rnmm.

rnrn

6.2.3. Mẫu có kích thước hạt to như dạng viên

rnrn

6.2.3.1. Nếu mẫu không lọt qua sàng có kích thước lỗ sàngrn3,00 mm thì cần nghiền mẫu (không ít hơn 500 gam) trên máy nghiền (4.1) cho đếnrnkhi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 3,00 mm, sau đó trộn thậtrnđều mẫu bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trongrnvòng 10 phút.

rnrn

6.2.3.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫurnđã trộn đều (6.2.3.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam.rnNghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máyrnnghiền (4.1) cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00rnmm.

rnrn

Mẫu thử được bảo quản trong các lọ đựng mẫu (4.25) ở điềurnkiện nhiệt độ 2 – 25⁰C, nơi khô ráo.

rnrn

Chú ý: Nên nghiền, trộn mẫu trong các phòng có thông gió,rnnên đeo kính, khẩu trang và găng tay bảo vệ.

rnrn

7. Cách tiến hành

rnrn

7.1. Chiết xuất mẫu

rnrn

7.1.1. Cân chính xác đến 0,01g từ 1 – 5 gam mẫu đã đượcrnnghiền mịn theo mục 6 (tuỳ theo hàm lượng kháng sinh có trong mẫu) cho vào ốngrnly tâm dung tích 50 ml, thêm tiếp 10 ml metanol. Đậy nắp ống ly tâm  và lắc ốngrntrong 15 phút ở tốc độ cao. Chuyển ống vào máy ly tâm lạnh, ly tâm trong 15rnphút ở tốc độ 4000 vòng/phút. Thu lấy dịch trong vào bình cô quay chân không.rnChiết lại lần 2 như trên. Gộp toàn bộ dịch chiết vào bình cô quay.

rnrn

7.1.2. Cô quay đến khô ở 35^oC, thêm 200 ml metanol và lắc nhẹ. Sau đó thêm tiếprn3,8 ml đệm acetate (2.5.1). Lắc đều và chuyển toàn bộ dung dịch vào ống ly tâmrn50ml. Tráng rửa bình bằng 1 ml đệm acetate, chuyển dịch rửa vào ống ly tâm.

rnrn

7.1.3. Loại chất béo bằng cách thêm 5ml n-hexan vào ốngrnly tâm chứa dịch mẫu (7.1.2), lắc nhẹ bằng tay. Sau đó lắc mạnh ống ly tâm trênrnmáy lắc trong 30 giây để phần chất lỏng phân lớp. Ly tâm lạnh ở 15^oCrnvới tốc độ 2000v/ph trong 5 phút. Dùng pipet loại bỏ nhanh phần hữu cơ. Thu lấy lớp acetat (có thể tích khoảngrn5ml) để làm sạch qua cột SPE và oxit nhôm.

rnrn

7.2. Chuẩn bị mẫurntrắng

rnrn

Mẫu trắng là mẫu thức ăn chăn nuôi được xác định là khôngrncó tylosin. Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự như mẫu thử theo 7.1.

rnrn

7.3. Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi

rnrn

Mẫu này được bổ sung một lượng tylosin xấp xỉ dung dịchrnchuẩn gốc. Ví dụ, chuẩn bị dịch mẫu thu hồi có hàm lượng tylosin là 1,25 mg/kg:rndùng pipet hút 0,625 ml dung dịch chuẩn làm việc 10 mg/ml (5.2.4.2) cho vào 5 gam mẫu trắngrn(7.2) mẫu được để yên trong 30 phút trước khi tiến hành chiết xuất. Sau đó tiếprntục quá trình chiết mẫu tương tự như đối với mẫu thử (7.1)

rnrn

7.4. Làm sạch mẫu

rnrn

7.4.1. Làm sạch bằng SPE:

rnrn

7.4.1.1. Hoạt hóa cột: 3 ml methanol, sau đó 5 ml nướcrncất

rnrn

7.4.1.2. Chuyển toàn bộ dịch chiết qua cột SPE (7.1.4)

rnrn

Lần lượt cho các dung dịch chiết thu được từ 7.1.3, 7.2rnvà 7.3 qua syranh vào cột SPE – C18 đã được chuẩn bị ở trên, dùng bơm hút chânrnkhông và điều chỉnh tốc độ chảy không quá 1ml/phút. KHÔNG ĐỂ CỘT BỊ KHÔrnTRONG GIAI ĐOẠN NÀY, tráng ống li tâm và rửa cột bằng rửa cột bằng 3 mlrnnước cất (tốc độ 1ml/phút), sau đó bằng 3 ml metanol (1ml/ phút).

rnrn

7.4.1.3. Thổi khô cột SPE. Rửa giải bằng 5 ml metanolrnchứa 1% diethylamine với tốc độ 1,5ml/phút.rnThổi khô dịch rửa giải bằng khí nitơ. Hoà tan bằng 1 ml đệm phosphate (6.2).

rnrn

7.4.2. Làm sạch qua cột nhôm oxit: Đặt cột nhôm oxit đãrnhoạt hóa (5.2.4.4) vào giá và giữ theo hướng thẳng đứng. Chuyển 1ml dịch làmrnsạch qua SPE ở trên (7.4.1.3) qua cột oxit nhôm. Để dịch chảy ra tự nhiên, bỏ 0,1mlrndịch đầu tiên. Thu 0,5 ml dịch chảy ra tiếp theo, lọc qua màng 0,45 mm vào lọ nhỏ chuyên dụng cho HPLCrn(4.22) để phân tích trên hệ thống sắc ký lỏng.

rnrn

7.5. Phân tích trên HPLC

rnrn

7.5.1. Điều kiện sắc ký: Nhiệt độ cột 30^oC;rndetector UV 280nm; Tốc độ dòng 0,7ml/phút; Thể tích bơm 50ml. Dung môi pha động A (5.2.3) và pharnđộng B (acetonitrile 100%). Chương trình dung môi gradient như sau:

rnrn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rnrn

7.5.2. Tiến hành

rnrn

7.5.2.1. Nên sử dụngrnbảo vệ cột, việc sử dụng bảo vệ cột không có bất cứ ảnh hưởng nào đến kết quảrnphân tích.

rnrn

7.5.2.2. Cân bằng hệrnthống sắc ký bằng pha động 30 phút trước khi bơm mẫu.

rnrn

7.5.2.3. Quy trìnhrnbơm mẫu theo thứ tự như sau: dịch mẫu trắng, các dung dịch chuẩn, dịch mẫu thurnhồi, dịch mẫu thử, các dung dịch chuẩn.

rnrn

Chú ý: Cần bơm cácrndịch chuẩn trước và sau mỗi đợt phân tích, không nên để quá 20 lần bơm mẫu chornmỗi đợt phân tích. Nếu quá 20 lần thì phải bơm các dung dịch chuẩn thêm lần nữarnvào khoảng giữa đợt bơm mẫu.

rnrn

7.5.2.4. Xác địnhrndiện tích (hoặc chiều cao) pic đối với các dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thửrntương ứng.

rnrn

7.5.2.5. Sau khi chạyrnmáy phải làm sạch hệ thống HPLC bằng hỗn hợp gồm nước cất : axetonnitril theorntỷ lệ thể tích 40:60 trong 30 phút để loại hết đệm trong hệ thống trước khi tắtrnmáy.

rnrn

8.rnTính toán kết quả

rnrn

8.1. Đường chuẩn

rnrn

8.1.1. Phải đảm bảornrằng các diện tích pic của mẫu thử đều nằm trong phạm vi của đường chuẩn. Nếurnmẫu thử nào có diện tích pic vượt quá diện tích của đường chuẩn ở nồng độ caornnhất thì sẽ bị loại và phải tiến hành thử lại với sự pha loãng.

rnrn

8.1.2. Xây dựng đườngrnchuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn vớirnnồng độ của tylosin theo quan hệ tuyến tính bậc 1: 

rnrn

y = ax + b

rnrn

Trong đó:          yrnlà diện tích pic (hoặc chiều cao pic)

rnrn

                        xrnlà nồng độ của kháng sinh

rnrn

                        arnlà hệ số góc

rnrn

                        brnlà hằng số

rnrn

8.2. Tính toán

rnrn

8.2.1. Hàm lượngrntylosin có trong mẫu thử được tính toán dựa vào đường chuẩn hồi qui tuyến tínhrn(8.1.2) theo công thức sau:

rnrn

rnrn

Trong đó:          Xrnlà hàm lượng tylosin có trong mẫu thử, tính bằng mg/kg

rnrn

                        Yrnlà hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết mẫu thử và diện tích pic của mẫurntrắng

rnrn

                        a,rnb là các thông số của đường chuẩn y = ax + b

rnrn

                        Vrnlà thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch (7.4.1.4), tính bằng ml

rnrn

                        mrnlà khối lượng mẫu thử, tính bằng gam

rnrn

8.2.2. Kết quả cuốirncùng là giá trung bình của hai lần phân tích nhắc lại. Trong quá trình tínhrntoán luôn phải lấy 2 số sau dấu phẩy. Giá trị trung bình được làm tròn đến mộtrnchữ số thập phân.

rnrn

8.2.3. Xác định độrnthu hồi (R) theo công thức sau:

rnrn

rnrn

Trong đó:

rnrn

C₁rnlà hàm lượng tylosin xác định được theo quy trình phân tích (tính bằng mg/kg)

rnrn

C là hàmrnlượng tylosin được nạp thêm vào mẫu (1,25 mg/kg)

rnrn

Độ thu hồi được xácrnđịnh cho mỗi lần chạy mẫu ít nhất phải đạt 80%.

rnrn

9.rnBáo cáo thử nghiệm

rnrn

Báo cáo kết quả phảirnbao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:

rnrn

–  Mọi thông tin cầnrnthiết để nhận biết mẫu thử.

rnrn

– Viện dẫn của tiêurnchuẩn này hoặc phương pháp thử.

rnrn

– Kết quả và đơn vịrnbiểu thị kết quả.

rnrn

– Ngày tháng lấy mẫurnvà kiểu loại lấy mẫu (nếu có).

rnrn

– Ngày tháng thửrnnghiệm.

rnrn

– Các điểm đặc biệtrnquan sát được trong quá trình thử nghiệm.

rnrn

– Mọi thao tác khôngrnqui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tuỳ chọn, cùng với các chi tiếtrncủa sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.

rnrn