Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 819:2006 về quy trình phân lập và giám định Streptococcus Suis

TIÊU CHUẨNrnNGÀNH

rnrn

10 TCNrn819:2006

rnrn

QUIrnTRÌNH PHÂN LẬP VÀ GIÁM ĐỊNH STREPTOCOCCUS SUIS

rnrn

Procedure forrnisolation and identification of Streptococcus suis

rnrn

1.rnPhạm vi áp dụng

rnrn

Qui trình này áprndụng cho công tác xét nghiệm trong phong thí nghiệm.

rnrn

2.rnKhái niệm

rnrn

– Streptococcus suisrnlà nguyên nhân của nhiều quá trình bệnh lý như viêm màng não, nhiễm trùng huyếtrntrong thời kỳ sơ sinh, viêm cuống phổi, viêm khớp và rối loạn sinh sảnrn(Tarradas C. và CS., 1994)

rnrn

– Nhiều chủng S.rnsuis có khả năng gây bệnh cho lợn. Hai chủng huyết thanh quan trongrnlà S. suis typ 1 (nhóm S) vàtyp 2(nhóm R),

rnrn

– S. suis type 1 (S)rnthường gây bệnh cho lợn con từ 2 – 4 tuần tuổi

rnrn

– S.suis type 2rn(R) gây bệnh cho lợn từ sau cai sữa cho đến 6 tháng tuổi

rnrn

– Người làm công tácrnthú y, tiếp xúc thường xuyên với lợn hoặc thịt lợn tưoi sống có thểrnbị nhiễm S. suis type 2 và mắc bệnh viêm màng não, viêm nội tâmrnmạc và nhiễm trùng huyết.

rnrn

3.rnNguyên liệu và dụng cụ

rnrn

3.1 máy móc

rnrn

– Tủ ấm 37^oC

rnrn

– Tủ sấy

rnrn

– Buồng cấy

rnrn

– Kính hiển vi có vậtrnkính dầu, vật kính khô hoặc phản pha

rnrn

– Nồi hấp ướt

rnrn

– Cân điện

rnrn

– Tủ lạnh

rnrn

– Lò vi sóng

rnrn

3.2 Dụng cụ

rnrn

– Panh, kéo nhỏ

rnrn

– Đèn cốn

rnrn

– Que cấy

rnrn

– Đĩa petri để đổ môirntrường

rnrn

– Lam kính

rnrn

– Kính lúp

rnrn

– Lamen (coverslip)

rnrn

3.3 Môi trường – hoárnchất – Nguyên liệu

rnrn

– Môi trường chọnrnlọc Streptococcus (Edward medium hoặc thạch máu có bổ xung polymicin B vàrncrystal violet)

rnrn

– Môi trường thạchrnmáu cừu/bò

rnrn

– Môi trường đườngrninulin, mannitol, raffinose, trehalose,

rnrn

– Môi trườngrnVoges- Proskauer (VP)

rnrn

– Môi trường nướcrnthịt có 6,5% Nacl.

rnrn

– Huyết thanh chuẩnrnstreptococcus nhóm D (R,S)

rnrn

rnrn

1. Lấy mẫu bệnhrnphẩm

rnrn

– Mẫu xét nghiệmrnlà hạch amidan, phổi, các phủ tạng, máu (thể nhiễm trùng huyết),rndịch rỉ viêm, dịch khớp và mủ.

rnrn

2. Soi kính hiển vi

rnrn

– Mủ và khuẩn lạcrnsau khi phân lập được dùng để phết kính nhuộm gram

rnrn

– Vi khuẩnrnstreptococcus suis bắt màu gram (+) có dạng hình cầu hơi dài hoặc hìnhrnquả trứng thường đứng đơn lẻ, xếp đôi, ít khi chuỗi ngắn.

rnrn

3. Phân lập

rnrn

– Xử lý vô trùngrnphía ngoài (đối với các bệnh phẩm là tổ chức) bằng đốt nóng cánrnpanh rồi áp vào bề mặt ngoài của tổ chức. Tổ chức ở phía trongrnđược dùng cho phân lập vi khuẩn.

rnrn

– Bệnh phẩm đượcrncấy lên các loại môi trường thạch máu (bò, ngựa, cừu) và môi trườngrnchọn lọc (chuẩn bị môi trường xem phụ lục), nuôi cấy ở 37^oC,rntrong 24 h

rnrn

– Khuẩn lạc S. suisrnmọc sau thời gian nuôi cấy có dạng nhỏ (khoảng 1-2mm) tròn trơn bóngrnláng hoặc nhẵn, thường gây dung huyết alfa hoặc không dung huyêt.

rnrn

– Các khuẩn lác nghirnS.suis cần phải được giám định

rnrn

4.rnGiám định vi khuẩn

rnrn

– Để giám định VK S.rnsuis có thể dùng 1 trong số những kit thương mại như API 20S, rapidrnSTREP (Analytab Products) hay RapID STR system (Innovative Diagnostic System)rnvà theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.

rnrn

Hoặc không, dựarnvào một số tính chất cơ bản sau của streptococcus suis (bảng 1)rnđể giám định:

rnrn

 (Các phương pháprnđể kiểm tra các tính chất sinh hoá trên được mô tả trong phần phụrnlục)

rnrn

Bảng 1: Một số tính chấtrncơ bản của Streptococcus suis dùng cho giám định

rnrn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rnrn

* TheornTarradas C. và cộng sự 1994; Quinn P.L. và Carter G.R., 1994.

rnrn

5.rnĐịnh typ huyết thanh

rnrn

– Vi khuẩn sau giámrnđịnh cần phải được kiểm tra tính chất kháng nguyên theo phân nhómrnLancefield bằng kit thương mại Latex Agglutination test cho S. suisrn(Wellcome Diagnostics; Difco laboratories; Scott Laboratories và DiagnosticrnProducts Corporation).

rnrn

6.rnTài liệu tham khảo

rnrn

Quinn P.L. và CarterrnG.R. 1994. Veterinary clinical microbiology. USA

rnrn

Swine disease. 1994, USA.

rnrn

Cẩm nang chẩn đoánrntiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam. 2002, Viện thú y quốc giarn– JICA.

rnrn

Sydney M. F. andrnEllen J. B. 1986. Bailey Diagnostic and Scott’s Microbiology. Ed 7^th.rnThe C. V. Moshy Company, Missouri, USA.

rnrn

Richard F. 2002. WhatrnHappened to the Streptococci: Overview of Taxonomic and Nomenclature Changes. ClinicalrnMicrobiology Reviews, 15; 4, p. 613-630.

rnrn

Tarradas C., ArenasrnA., Maldonado A., Luque I., Miranda A. and Perea A. 1994. identification of Streptococcusrnsuis Isolated from Swine: Proposal for Biochemical Parameters. Journalrnof Clinical Microbiology, 32; 2 p. 578-580.

rnrn

Ashish A. S.,rnShreekumar R. P. and Bhushan M. J. 2002. Evaluation of five selective media forrnisolation of catalase-negative gram-positive cocci from bulk tank milk. Journalrnof dairy science, 85, p 1127-1132.

rnrn

Gottschalk M.,rnHiggins R. ans Boudreau M. 1993. Use of polyvalent coagglutination reagents forrnserotyping of streptococcus suis. Journal of Clinical Microbiology. 31;rn8, p. 2192-2194.

rnrn

Florence B. H., Roland C.,rnAnnie L., Marcelo G., Jean-Yves C. and Marylene K. 2001. The Canadianrnjournal of veterinary research. 65, p. 196-200.

rnrn

Gottschalk M.,rnLacouture S. and Odierno L. 1999. Immunomagnetic isolation of streptococcus serotypesrn2 and from swine tonsils. Journal of clinical microbiology. 37; 9, p. 2877-2881

rnrn

rnrn

rn

rn

rn

rnrn

rnrn

PHỤrnLỤC

rnrn

1. Chuẩn bị thạchrnmáu

rnrn

Nguyên liêu:

rnrn

– Thạch máu cơrnbản/ Blood agar base

rnrn

– Máu cừu/bò sạchrnbệnh

rnrn

– Nước cất

rnrn

Chuẩn bị theornhướng dẫn của nhà sản xuất

rnrn

– Thạch máu cơ bảnrnđược hoà với nước cất theo tỉ lệ rồi đun cho tan hết, sau đó hấp ởrn121^oC 15 phút. Sau khi hấp để nguội đến khoảng 37^oCrnthi cho thêm 5-7% máu cừu hoặc bò, lắc nhẹ cho đều rồi đổ ra đĩarnPetri.

rnrn

2. Chuẩn bị môirntrường chọn lọc

rnrn

Hiện nay có râtrnnhiêu loại môi trường dùng cho phân lập vk Streptococcus tuy nhiên nhữngrnloại môi trường sau thường hay được dùng.

rnrn

a) Edwards modifiedrnmedium

rnrn

Nguyên liệu:

rnrn

– Edwards modifiedrnmedium

rnrn

– Máu cừu/bò

rnrn

– Colistin

rnrn

– Oxonlinic acid

rnrn

– Nước cất

rnrn

Chuẩn bi

rnrn

– sau khi chuẩn theornhướng dẫn của nhà sản xuất có thể bổ xung colistin 5 mg/L andrnoxonlinic acid 2,5 mg/L and 5% máu cừu/bò để làm tăng khả năng mọc củarnvi khuẩn.

rnrn

 Vì trong môi trườngrnEdward có chứa aesculin nên môi trường này có thể dùng để kiểm trarntính chât thuỷ phân aesculin của vi khuân có thể nhận biết nếu khuẩnrnlạc và môi trường có màu đen (hay dương tính thuỷ phân aesculin)

rnrn

b) Môi trường thạchrnmáu được bổ xung polymyxin B và Crystal violet

rnrn

– Thạch máu cơrnbản/ Blood agar base

rnrn

– Máu cừu/bò sạchrnbệnh

rnrn

– Nước cất

rnrn

– polymyxin B

rnrn

– Crystal violet

rnrn

Chuẩn bị

rnrn

– Môi trường thạchrnmáu sau chuẩn bi theo hướng dẫn của nhà sản xuất như đă nói ở phầnrnchuẩn bị thạch máu được bổ xung thêm polymyxin B 10 mg/L và Crystalrnviolet 1mg/L ngay sau khi cho máu vào môi trường.

rnrn

3. Phương pháp kiểmrntra khả năng sản sinh acetoin trong môi trường VP

rnrn

Các môi trường vàrnhoá chất cần có bao gồm:

rnrn

a) Môi trường VPrnthương phẩm, có chứa peptoné, glucose và buffer

rnrn

Chuẩn bị như sau:

rnrn

Buffered peptone 7g

rnrn

Glucose 5g

rnrn

Dipotasium phosphate 5g

rnrn

Nước cất 1000ml

rnrn

b) Thuốc thử A

rnrn

Alpha naphthol (SigmarnChemical Co.) 5g

rnrn

Ethyl alcohol (thuầnrnkhiết) 100ml

rnrn

Hoà tan Alpharnnaphthol trong một lượng nhỏ Ethyl alcohol rồi đổ thêm cho đủ 100 mlrntrong bình thuỷ tinh tam giác. Giữ trong lọ nâu ở nhiệt độ 4^oC

rnrn

c) Thuốc thử B

rnrn

Potassium hydroxidern(KOH) 40g

rnrn

Nước cất 100ml

rnrn

– KOH phải được pharntrong bình thuỷ tinh đặt trong nước lạnh để tránh sinh nhiệt. Khi cânrnKOH phải cân thật nhanh vì KOH dễ hút ẩm và là chất ăn da khi bị ẩm,rnsau đó cho vào bình thuỷ tinh rồi cho một lượng khoảng 90ml nước cất.rnSau khi lắc cho tan thì cho thêm 10ml cho đủ lượng. Chất thử này đượcrngiữ trong bình nhưa ở nhiệt độ 4^oC.

rnrn

d) Phương pháp kiểmrntra:

rnrn

– Sau khi nuôi cấyrnvi khuẩn phân lập được trong môi trường VP ít nhất 48 giờ ở nhiệt độrn37^oC lấy 2,5 ml canh trùng cho vào 1 ống nghiệm nhỏ vô trùng.rnSau đó cho 0,6 ml (6 giọt) thuốc thử A rồi 0,2 ml (2 giọt) thuốc thử B.rnSau khi cho các thuốc thử , lắc nhẹ ống nghiệm rồi để 15 phút đem đọcrnkết quả:

rnrn

– Nếu môi trườngrncó màu hồng là phản ứng dương tính, màu vàng hoặc không màu là âmrntính.

rnrn

4. Phương pháp kiêmrntra khả năng thuỷ phân aesculin

rnrn

– Có thể dùng môirntrường Edward để kiểm tra tính chất này như đă nói ở phần chuẩn bịrnmôi trường Edward.

rnrn

– Hoặc có thểrndùng môi trường lỏng có chứa aesculin được chuẩn bị như sau để kiẻmrntra

rnrn

Aesculin 1g

rnrn

Peptone water 1000ml

rnrn

Feric cirtate 0,5 g

rnrn

Sau khi cho cácrnthành phần vào với nhau, lắc cho tan rồi hấp ở 115^oC trongrn10 phút. Giữ ở nhiệt độ 4^oC. Nuôi cấy trong môi trường nàyrnở 37^oC và theo dõi trong 7 ngày nếu môi trường chuyển từrnmàu nâu sậm sang màu đen là dương tính.

rnrn

5. Phương pháp kiểmrntra khả năng lên men đường (inulin, lactose, mannitol, raffinose, trehalose).

rnrn

a) Chuẩn bị môirntrường

rnrn

Peptone water 100ml

rnrn

Chỉ thị màurnandrade 1ml

rnrn

Sau khi cho cácrnthành phần vào với nhau, lắc cho đều rồi chia vào các ống nghiệm,rnmỗi ống 4 ml.

rnrn

b) Chỉ thị maurnandrade

rnrn

Fucsin acid 0,5g

rnrn

Nước cất 100ml

rnrn

Dung dịch NaOH-1N 16ml

rnrn

– Nghiền fucsinrntrong cối sứ nhỏ mịn rồi hoà vào nước cất cho tan hết. Cho vào từ từrndung dịch NaOH-1N, vừa cho vừa lắc đến khi nào mầu từ đỏ tươi chuyểnrnthành đỏ nâu, rồi đến khi vàng úa, vàng thẫm thì thôi (lượng NaOHrnnhỏ vào thường từ 12-17 ml, trung bình 16 ml là vừa). Để lắng 1-2 giờrnrồi lọc qua giấy lọc. Hấp ướt 120^oC trong 15 phút.

rnrn

c) Dung dịch đường

rnrn

Trehalose 10g

rnrn

Nước cất 100ml

rnrn

Hoà tan Trehalose (inulin,rnlactose, mannitol, raffinose) trong nước cất rồi hấp ở 110^oCrntrong vòng 20 – 30 phút. Dung dịch đường được giữ ở nhiệt độ 4^oC.

rnrn

d) Phương pháp kiểmrntra:

rnrn

– Mỗi ống môirntrường peptone có chỉ thị màu andrade (4ml) được cho 0,3 ml dung dịchrnđường. Cấy giống vi khuẩn phân lập được vào môi trường rồi để tủ ấmrn37^oC sau 24 giờ lấy ra đọc kết quả.

rnrn

– Nêu môi trườngrnkhông thay đổi màu. màu vẫn vàng tức là vk không sinh acid, phản ứngrnâm tính.

rnrn

– Nếu môi trườngrnchuyển từ màu vàng sang đỏ tức là vi khuẩn sinh acid, phản ứng dươngrntính

rnrn

6. Phương pháp kiểmrntra khả năng mọc trên môi trường có 6,5% NaCl

rnrn

a) Chuẩn bị môirntrường

rnrn

Nước Peptone 100ml

rnrn

NaCl 6,5g

rnrn

– Cho các thànhrnphần vào nhau rồi lắc cho tan, chia vào các ống (mỗi ống 5ml) sau đórnhấp ướt ở 110^oC trong vòng 20 phút. Cất ở 4^oC.

rnrn

b) Phương pháp kiểmrntra

rnrn

– Cây vi khuẩn vàornống môi trường để ở 37^oC sau 24 giờ đem ria cấy lại trên môirntrường chọn lọc nếu có vi khuẩn mọc trên môi trường chọn lọc córnnghĩa là vi khuẩn đã sống được trong môi trường có 6,5% NaCl. Ngượcrnlại vi khuẩn không có khả năng mọc trong môi trường có 6,5% NaCl .

rnrn

rnrn