Nhập từ khoá: Số Hiệu, Tiêu đề hoặc Nội dung ngắn gọn của Văn Bản...
Tiêu chuẩn ngành 10TCN 867:2006 về vi sinh vật – Phương pháp đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn
- Tóm tắt
- Nội dung
- Hiệu lực
- Lược đồ
- Tải về
- VB liên quan
Thuộc tính Tiêu chuẩn ngành 10TCN 867:2006 về vi sinh vật – Phương pháp đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn
| Số hiệu: | 10TCN867:2006 | Loại văn bản: | Tiêu chuẩn ngành |
| Cơ quan ban hành: | Đã xác định | Ngày ban hành: | 01/01/2006 |
| Người ký: | Đã xác định | Ngày có hiệu lực: | 01/01/1970 |
| Tình trạng hiệu lực: | Còn hiệu lực |
Tóm tắt văn bản
“rnrnrnrnrnrn
rnrn
rnrn
rnrn
rnrn
Tiêurnchuẩn này áp dụng cho việc xác định, kiểm tra mật độ và hoạt tính đối kháng củarncác vi sinh vật đối với nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn (cây hàng năm)
rnrn
rnrn
2.1.
rnrn
– Có khảrnnăng tiêu diệt hoặc ức chế sự phát triển hay làm mất hoặc giảm độc tính gâyrnbệnh vùng rễ cây trồng
rnrn
– Tạornđược vòng đối kháng (vòng tròn trong suốt) bao quanh khuẩn lạc/cụm khuẩn lạcrncủa vi sinh vật đó khi tiếp xúc với nấm bệnh trên môi trường nuôi cấy nhân tạo
rnrn
– Làmrngiảm được tỷ lệ bệnh do nấm gây ra trên cây chủ
rnrn
2.2. Hoạtrntính đối kháng của vi sinh vật đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng
rnrn
rnrn
3.1. Xácrnđịnh hoạt tính đối kháng trong điều kiện phòng thí nghiệm
rnrn
3.1.1.rnThiết bị và dụng cụ
rnrn
3.1.1.1.rnThiết bị khử trùng:
rnrn
| rn – Nồi hấp khửrn trùng: Áp suất tối thiểu 1 at (tương đương nhiệt độ khử trùng 1210C) rn |
| rn – Tủ sấy: Nhiệt độ từ 40 đến 2600C rn |
rnrn
3.1.1.2. Thiết bị nuôi cấy virnsinh vật:
rnrn
| rn – Tủ ấm: Nhiệt độ tối đa 600C rn |
| rn – Tủ ấm lạnh: Nhiệt độ 20- 600C rn |
| rn – Buồng cấy vôrn trùng rn |
| rn – Máy lắc ổn nhiệt:rn Tốc độ 150 vòng/phút, nhiệt độ tối đa 600C rn |
rnrn
3.1.1.3.rnThiết bị đo lường:
rnrn
| rn – Cân phân tíchrn (d=0,001) rn |
| rn – Cân kỹ thuậtrn (d=0,1) rn |
| rn – Máy đo pH rn |
| rn – Máy đếm khuẩn lạc rn |
| rn – Micropipet:rn 50-200µl; 200-1000µl; 500-5000µl rn |
rnrn
3.1.1.4.rnMáy cất nước 2 lần
rnrn
3.1.1.5.rnDụng cụ thuỷ tinh:
rnrn
| rn – Bình tam giác:rn 100, 250, 500 ml rn |
| rn – Cốc thuỷ tinh:rn 100, 250, 500,1000 ml rn |
| rn – Cốc định lượng:rn 50, 100, 500 ml rn |
| rn – Petri: đường kínhrn 90mm rn |
| rn – Ống nghiệm:rn 18x180mm rn |
rnrn
3.1.2.rnMôi trường nuôi cấy và hoá chất khác
rnrn
3.1.2.1.rnMôi trường nuôi cấy
rnrn
– Môirntrường PDA
rnrn
– Môi trườngrnThạch-Thịt-Pepton
rnrn
– Môirntrường Czapek
rnrn
– Môirntrường Gauze
rnrn
3.1.2.2.rnHoá chất khác
rnrn
| rn – rn |
| rn – NaOH rn |
| rn – Kháng sinhrn (Streptomycin, Rifamycin, Spectamycin) rn |
rnrn
3.1.3.rnChuẩn bị
rnrn
3.1.3.1. Khử trùng dụng cụrnvà đất
rnrn
– Các dụng cụ sử dụngrntrong nuôi cấy, nhiễm vi sinh vật và xác định hoạt tính của vi sinh vật phảirnđược khử trùng bằng 1 trong 2 cách: Sấy ở nhiệt độ 1800C không ítrnhơn 1 giờ trong tủ sấy hoặc giữ ở áp suất 1,0 atmotphe (tương đương1210C)rnkhông ít hơn 30 phút trong nồi hấp khử trùng
rnrn
– Đất được sử dụng trongrnphép thử nghiệm trên cây trồng được giữ ở áp suất 1,5 atmotphe không ít hơn 1rngiờ trong nồi hấp khử trùng
rnrn
3.1.3.2. Dịch vi sinh vật
rnrn
a. Dịch nấm bệnh vùng rễ
rnrn
– Cấy giống: Lựa chọn nhữngrnbào tử của chủng nấm bệnh có độc tính đã được kiểm tra khả năng gây bệnh vùngrnrễ cây trồng, cấy chuyển vào môi trường PDA. Nuôi cấy trên môi trường thạch đĩarntrong thời gian 3-5 ngày ở nhiệt độ 28-300C cho đến khi bào tử nấmrnmọc đầy trên đĩa thạch
rnrn
– Pha mẫu: Dùng que cấy vôrntrùng lấy bào tử nấm bệnh đưa vào ống nghiệm thuỷ tinh đã chứa 5ml nước cất vôrntrùng, trộn đều bằng thiết bị lắc cơ học
rnrn
b. Dịch vi sinh vật đốirnkháng
rnrn
Vi sinh vật đối kháng đượcrnnuôi cấy trong môi trường (xem phần phụ lục)ở điều kiện nhiệt độ, pH vàrnthời gian thích hợp với từng loài sao cho mật độ sau nuôi cấy đạt 108-1010CFU/ml
rnrn
3.1.4.rnTiến hành
rnrn
3.1.4.1. Cấy mẫu nấm bệnh
rnrn
– Dùng micropipet vô trùngrnhút 0,10ml dịch nấm bệnh (phần a mục 3.1.3.2) cấy vào đĩa petri chứa 30ml môirntrường PDA (lớp thạch thứ nhất) đã chuẩn bị sẵn
rnrn
– Lắc nhẹ đĩa petri chorndịch nấm bệnh tràn đều trên bề mặt thạch, dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đếnrnkhi dịch nấm bệnh thấm hoàn toàn trên bề mặt thạch. Chú ý không để dịch nấmrnbệnh dính vào thành đĩa petri
rnrn
– Sau khi bề mặt thạch khôrn(khoảng 4 giờ), phủ tiếp 20 ml môi trường thích hợp phụ thuộc vào vi sinh vậtrnđối kháng (lớp thạch thứ hai) lên lớp thạch thứ nhất đã cấy nấm bệnh.rnCác đĩa thạch được để khô trong 45 phút. Lưu ý: nhiệt độ của môi trường khi phủrnlên trên lớp thạch thứ nhất từ 350 đến 450C, độ dày củarnlớp thạch thứ hai dày 2 đến 3mm
rnrn
– Mỗi mẫu lặp lại 3 lần
rnrn
3.1.4.2. Cấy mẫu vi sinhrnvật đối kháng
rnrn
a. Pha loãng mẫu
rnrn
– Dùng micropipet vô trùngrnlấy ra 10ml dịch vi sinh vật đối kháng đưa vào bình thuỷ tinh chứa 90ml dungrndịch muối sinh lý vô trùng (0,85% NaCl trong nước cất), trộn đều bằng thiết bịrntrộn cơ học
rnrn
– Dùng micropipet vô trùngrntiếp tục lấy 1ml dịch cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng,rntrộn đều bằng thiết bị lắc cơ học. Quá trình này được lặp lại cho đến khi đượcrndịch vi sinh vật đối kháng có mật độ thích hợp có thể đếm được khuẩn lạc trênrnđĩa thạch
rnrn
b. Cấy mẫu
rnrn
Dùng micropipet vô trùngrnhút 0,05ml dịch vi sinh vật đối kháng (phần a mục 3.1.4.2) cấy vào lớp thạchrnthứ hai. Lắc nhẹ đĩa petri cho dịch vi sinh vật đối kháng tràn đều trên bề mặtrnthạch, dùng que gạt vô trùng gạt đều cho đến khi dịch vi sinh vật đối khángrnthấm hoàn toàn trên bề mặt lớp thạch thứ hai. Chú ý không để dịch vi sinh vậtrnđối kháng dính vào thành đĩa petri. Các đĩa thạch được nuôi cấy giữ ở điều kiệnrnnhiệt độ và thời gian thích hợp
rnrn
3.1.5.rnĐọc kết quả
rnrn
Hoạt tính đối kháng của virnsinh vật đối kháng được thể hiện thông qua vòng đối kháng (vòng tròn trong suốtrnbao quanh khuẩn lạc của vi sinh vật đối kháng), được tính bằng trung bình cộngrngiá trị kích thước vòng vô khuẩn của 3 lần lặp lại, biểu thị bằng công thức:
rnrn
rnrn
Trong đó:
rnrn
– D là đường kính vòng vôrnkhuẩn (mm)
rnrn
– d là đường kínhrnkhuẩn lạc (mm)
rnrn
Số lượng tế bào vi sinhrnvật có hoạt tính đối kháng trong 1ml dịch được thể hiện thông qua số lượngrnkhuẩn lạc tạo được vòng đối kháng bao quanh khuẩn lạc và được tính bằng côngrnthức:
rnrn
rnrn
Trong đó:
rnrn
– A là số lượng vi sinhrnvật đối kháng/ml
rnrn
– a là số lượng khuẩn lạcrncó vòng đối kháng
rnrn
– c là tỉ lệ nghịch đảorncủa nồng độ pha loãng
rnrn
–
rnrn
3.2. Xácrnđịnh hoạt tính đối kháng trên cây trồng
rnrn
3.2.1.rnDụng cụ, thiết bị, vật tư
rnrn
– Dụng cụ và thiết bị: Nhưrnmục 3.1.1.
rnrn
– Vật tư: Đất trồng, hạtrnhoặc củ giống, phân bón, nước vô trùng, v.v…
rnrn
3.2.2.rnChuẩn bị vật liệu
rnrn
3.2.2.1. Đất trồng, hạtrngiống, phân bón
rnrn
– Thử nghiệm được tiếnrnhành trên đất khử trùng tơi xốp, có hàm lượng hữu cơ không nhỏ hơn 1,5% và pHrntừ 6,0 đến 6,5. Đất trồng được đựng trong các chậu vại hoặc khay với lượng đấtrnphù hợp cho từng đối tượng cây chủ
rnrn
– Hạt hoặc củ giống sửrndụng là hạt hoặc củ giống sạch, giống mẫn cảm và được khử trùng bề mặt bằngrndung dịch 4% H2O2
rnrn
– Phân bón được sử dụngrnvới liều lượng và chủng loại theo qui trình chung đối với từng loại cây trồng
rnrn
3.2.2.2. Dịch vi sinh vật
rnrn
a. Dịch nấm gây bệnh
rnrn
– Nấm gây bệnh được nuôirncấy trên môi trường thạch đĩa (môi trường PDA). Chọn những ống giống thuần, cấyrntruyền trên môi trường thạch đĩa PDA và nuôi ở nhiệt độ28-300C.rn
rnrn
– Sau 4-5 ngày, chuyểnrntoàn bộ sinh khối từ đĩa thạch vào 5ml nước cất vô trùng; trộn đều để đạt đượcrnmật độ 108CFU/ml.
rnrn
b. Dịch vi sinh vật đốirnkháng
rnrn
Vi sinh vật đối kháng đượcrnchuẩn bị theo phần b mục 3.1.3.2
rnrn
3.2.3.rnTiến hành thử nghiệm
rnrn
3.2.3.1. Bố trí thử nghiệm
rnrn
– Thử nghiệm được tiếnrnhành với 2 công thức: Đối chứng (nhiễm nấm bệnh), thí nghiệm (nhiễm hỗn hợp virnsinh vật đối kháng với nấm bệnh). Mỗi công thức được lặp lại không ítrnhơn 3 lần với tổng số cây ít nhất là 50 cây
rnrn
– Thí nghiệm được thựcrnhiện trong buồng sinh trưởng, bảo đảm hạn chế tối đa ảnh hưởng của các yếu tốrnphi thí nghiệm
rnrn
3.2.3.2. Tiến hành thửrnnghiệm
rnrn
– Vi sinh vật đối khángrnđược nhiễm vào đất trước khi gieo trồng với mật độ vi sinh vật 10 8CFU/mlrnđối với công thức thí nghiệm
rnrn
– Ngâm hạt hoặc củ giốngrntrong dịch nấm bệnh mật độ 10 8CFU/ml đã được chuẩn bị trong thờirngian 30 phút
rnrn
– Gieo trồng hạt hoặc củrnđã nhiễm nấm bệnh vào đất vô trùng đối với công thức đối chứng và đất đã đượcrnnhiễm vi khuẩn đối kháng đối với công thức thí nghiệm
rnrn
– Thí nghiệm được chăm sócrntheo qui trình phù hợp với từng đối tượng cây chủ;
rnrn
– Trong thời gian 30-45rnngày kể từ khi gieo trồng, phải quan sát và ghi nhận hàng ngày tình trạng sứcrnkhoẻ của cây trồng (không có triệu chứng bệnh hoặc có triệu chứng bệnh)
rnrn
3.2.4.
rnrn
Tỉ lệ cây bệnh được tínhrntheo công thức:
rnrn
| rn rn | rn rn | rn x 100 rn |
| rn rn |
rnrn
So sánh tỷ lệ cây bị bệnh giữa công thức thí nghiệm vớirncông thức đối chứng và đánh giá hoạt tính đối kháng của vi sinh vật theo cácrncấp độ sau:
rnrn
| rn rn | rn rn | rn rn |
| rn rn | rn rn | rn rn |
| rn rn | rn rn | rn rn |
| rn rn | rn rn | rn rn |
| rn rn | rn rn | rn rn |
| rn rn | rn rn | rn rn |
rnrn
rnrn
rnrn
B.1. Môirntrường nuôi cấy nấm bệnh
rnrn
Thànhrnphần môi trường PDA (gam/lít)
rnrn
| rn – Dextrose: rn | rn rn |
| rn – Khoai tây: rn | rn rn |
| rn – Thạch: rn | rn rn |
| rn – pH: rn | rn rn |
rnrn
Ghi chú:
rnrn
– Khoai tây thái nhỏ, cho vào 1 lít nước và đun sôi trongrn20 phút, sau đó lọc lấy nước trong để sử dụng làm môi trường
rnrn
– Bổ sung 0,2% kháng sinh trong 100 ml môi trường đã khử trùng trước khi đổ ra đĩarnpetri
rnrn
B.2. Môirntrường nuôi cấy vi sinh vật đối kháng
rnrn
– Trongrntrường hợp đã biết rõ loài vi sinh vật đối kháng cần xác định, môi trường đượcrnsử dụng để nuôi cấy là môi trường đặc hiệu hoặc môi trường có thành phần thíchrnhợp cho sự sinh trưởng phát triển của loài vi sinh vật đã biết.
rnrn
– Trườngrnhợp chưa biết chính xác vi sinh vật cần xác định thì lựa chọn một trong các môirntrường nuôi cấy như sau:
rnrn
B.rn2.1.Môi trường cho vi khuẩn: Môi trường Thạch-Thịt-Pepton
rnrn
Thànhrnphần môi trường (gam/lít):
rnrn
| rn – Pepton: rn | rn rn |
| rn – Cao thịt: rn | rn rn |
| rn – Thạch: rn | rn rn |
| rn – Nước cất: rn | rn rn |
| rn – pH: rn | rn rn |
rnrn
(pH môirntrường được điều chỉnh bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N)
rnrn
B.2.2.rnMôi trường nuôi cấy nấm: Môi trường Czapek
rnrn
Thànhrnphần môi trường (gam/lít):
rnrn
| rn – NaNO3 : rn | rn rn |
| rn – Sacaroza: rn | rn rn |
| rn – KH2PO4rn : rn | rn rn |
| rn – MgSO4.7H2O: rn | rn rn |
| rn – Thạch: rn | rn rn |
| rn – Nước cất: rn | rn rn |
| rn – pH: rn | rn rn |
rnrn
(pH môirntrường được điều chỉnh bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N)
rnrn
B.2.3.rnMôi trường cho xạ khuẩn: Môi trường Gauze
rnrn
Thànhrnphần môi trường (gam/lít):
rnrn
| rn – Tinh bột tan: rn | rn rn |
| rn – KNO3: rn | rn rn |
| rn – KH2PO4rn : rn | rn rn |
| rn – MgSO4.7H2O: rn | rn rn |
| rn – NaCl: rn | rn rn |
| rn – FeSO4: rn | rn rn |
| rn – Thạch: rn | rn rn |
| rn – Nước cất: rn | rn rn |
| rn – pH: rn | rn rn |
rnrn
(pH môirntrường được điều chỉnh bằng HCl 1N hoặc NaOH 1N)
rnrn
Ngoài rarntrong điều kiện hạn hẹp có thể sử dụng môi trườ
rnrn
rnrnrnrnrn”
Hiệu lực
Cung cấp thông tin về văn bản gồm ngày ban hành, ngày có hiệu lực, ngày hết hiệu lực, trạng thái hiệu lực của văn bản.
Lược đồ văn bản
|
Văn bản được hướng dẫn -
[0]
...
Văn bản được hợp nhất -
[0]
...
Văn bản bị sửa đổi bổ sung -
[0]
...
Văn bản bị đính chính -
[0]
...
Văn bản bị thay thế -
[0]
...
Văn bản được dẫn chiếu -
[0]
...
Văn bản được căn cứ -
[0]
...
Văn bản đang xem
Tiêu chuẩn ngành 10TCN 867:2006 về vi sinh vật – Phương pháp đánh giá hoạt tính đối kháng nấm gây bệnh vùng rễ cây trồng cạn
Văn bản hướng dẫn -
[0]
...
Văn bản hợp nhất -
[0]
...
Văn bản sửa đổi bổ sung -
[0]
...
Văn bản đính chính -
[0]
...
Văn bản thay thế -
[0]
...
Văn bản liên quan cùng nội dung -
[0]
...
|
||||||||||||||||||||||
Văn bản Tiếng Việt
Chưa có file đính kèm.
