Tiêu chuẩn ngành 10TCN 835:2006 về thức ăn chăn nuôi – xác định hàm lượng monensin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn banh hành

rnrn

TIÊU CHUẨN NGÀNH

rnrn

10TCN 835 : 2006

rnrn

THỨC ĂN CHĂN NUÔI -rnXÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG MONENSIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

rnrn

Animalrnfeeding stuffs – Determination of monensin content by

rnrn

high – performance liquid chromatographic method

rnrn

(Ban hành kèm theo Quyếtrnđịnh số 4099/QĐ/BNN-KHCN ngày       tháng 12 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nôngrnnghiệp và Phát triển nông thôn)

rnrn

1.rnPhạm vi áp dụng

rnrn

Tiêu chuẩn này áp dụng để phân tích hàm lượng kháng sinhrnmonensin trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng caorn(HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 40mg/kg.

rnrn

2. Tài liệu viện dẫn

rnrn

Các tài liệu viện dẫn sau đây rất cần thiết cho việc áprndụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụngrnphiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áprndụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi:

rnrn

TCVN 4851 (ISO 3696). Nước dùng để phân tích trong phòngrnthí nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

rnrn

ISO 6497:2002 (E). Animal feeding stuffs – Sampling.

rnrn

3.rnNguyên tắc

rnrn

Monensin trong mẫu thức ăn chăn nuôi được tách chiết bằngrnmetanol, sau đó tạo dẫn xuất bằng 2,4 dinitrophenylhydrazine (DNP) trong môirntrường axit ở 55^oC, tách và định lượng trên hệ thống sắc ký lỏngrnhiệu năng cao với detector UV ở bước sóng 392nm.

rnrn

4.rnThiết bị, dụng cụ

rnrn

4.1. Máy nghiền mẫu phòng thí nghiệm.

rnrn

4.2. Sàng phòng thí nghiệm, có kích thước lỗ sàng 1,00 mmrnvà 3,00 mm.

rnrn

4.3. Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g.

rnrn

4.4. Cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01 g.

rnrn

4.5. Máy ly tâm lạnh có tốc độ 3000 vòng/phút,rnsử dụng ống ly tâm dung tích 30 ml.

rnrn

4.6. ống ly tâm, dung tích 30 ml bằng polypropylen hoặcrnbằng thuỷ tinh, có nắp đậy.

rnrn

4.7. Tủ ấm, có khả năng duy trì nhiệt độ ổn định ở 55^oCrn± 1^oC.

rnrn

4.8. Máy lắc tròn hoặc máy lắc ngang có thể đạt tốc độrn250 vòng/phút.

rnrn

4.9. ống nghiệm dung tích 10ml có nút xoáy.

rnrn

4.10. Bình định mức dung tích 10, 100, 1000 ml.

rnrn

4.11. Pipet tự động điều chỉnh được từ  1ml đến 30 ml.

rnrn

4.12. Micropipet dung tích từ 10ml đến 100 ml và từ 200ml đến 1000 ml.

rnrn

4.13. Hút dung môi tự động 2 ml, 10 ml, 20 ml.

rnrn

4.14. Máy lắc ống nghiệm (Vortex mixer).

rnrn

4.15. ống đong 1000ml.

rnrn

4.16. Bể siêu âm.

rnrn

4.17. Bơm hút chân không.

rnrn

4.18. Màng lọc syranh có kích thước 0,45 mm.

rnrn

4.19. Bình nón dung tích 125ml.

rnrn

4.20. Lọ nhỏ đựng dịch mẫu chuyên dụng cho HPLC, có nắprnvặn PTFE .

rnrn

4.21. Thiết bị trộn mẫu phòng thí nghiệm loại HobartrnModel C 100 T hoặc tương đương.

rnrn

4.22. Thiết bị chia mẫu:

rnrn

Thiết bị chia đôirnhoặc chia tư mẫu: ví dụ như thiết bị chia tư hình nón, thiết bị chia nhiều ngănrncó hệ thống phân hạt hoặc các thiết bị chia khác đảm bảo phân chia mẫu thírnnghiệm thành mẫu thử đồng nhất.

rnrn

4.23. Hộp đựng mẫu córnnắp kín.

rnrn

4.24. Hệ thống HPLC gồm có:

rnrn

4.24.1. Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao, bình chứa dungrnmôi, hệ thống bơm mẫu, detector UV đặt được ở bước sóng 392nm, máy ghi hoặc bộrntích phân.

rnrn

4.24.2. Cột phân tích HPLC pha đảo có kèm cột bảo vệ

rnrn

            Chiều dài                         150mm

rnrn

            Đường kính trong            4,6mm

rnrn

            Hạt nhồi                           C 18; 5mm hoặc tương đương

rnrn

5. Hóa chất và thuốc thử

rnrn

5.1. Hoá chất

rnrn

Chỉ sử dụng hoá chất được công nhận đạt chất lượng tinhrnkhiết phân tích và nước cất cấp hạng 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696). Các dung môirnphải đạt chất lượng để dùng cho phân tích HPLC.

rnrn

5.1.1. Metanol.

rnrn

5.1.2. Axit acetic (100%).

rnrn

5.1.3. Acetonitrile

rnrn

5.1.4. Chất chuẩn monensin, dạng muối natri monensin,rnloại tinh khiết, có kèm theo giấy chứng nhận hàm lượng.

rnrn

5.2. Thuốc thử

rnrn

5.2.1. Tricloacetic axit (TCA), dung dịch 500mg/ml.

rnrn

Cân 50g TCA chính xác đến 0,01g cho vào bình định mứcrn100ml, hòa tan và định mức bằng nước cất. Lắc kỹ dung dịch.

rnrn

5.2.2. Thuốc thử DNP, dung dịch 1mg/ml trong metanol.

rnrn

Cân 100mg DNP chính xác đến 1mg vào bình định mức 100ml,rnhòa tan và định mức đến vạch bằng metanol. Lắc kỹ dung dịch.

rnrn

5.2.3. Pha động cho HPLC.

rnrn

Hỗn hợp metanol: dung dịch axit acetic 1,5% tỉ lệ 90:10rntheo thể tích (v/v).

rnrn

5.2.3.1. Dung dịch axit acetic 1,5% trong nước, theo tỉrnlệ thể tích (v/v).

rnrn

Cho 15ml axit acetic (5.1.2) vào bình định mức 1000ml.rnThêm nước cất đến vạch định mức. Lắc đều dung dịch.

rnrn

5.2.3.2. Hỗn hợp pha động.

rnrn

Cho 900ml metanol vào ống đong dungrntích 1000ml. Thêm tiếp 100ml dung dịch axit acetic 1,5% (5.2.3.1). Sau đó lọc hỗn hợprndung môi thu được qua phễu hút chân không với màng lọc có kích thước lỗ 0,45 mm, siêu âm đuổi khí ở nhiệt độ thườngrntrong 30 phút.

rnrn

5.2.4. Dung dịch chuẩn

rnrn

5.2.4.1. Dung dịch chuẩn gốc 1000mg/ml

rnrn

Tùy theo hàm lượng monensin ghi trong giấy chứng nhậnrn(5.1.4), cân một lượng nhất định chất chuẩn natri monensin chính xác đến 0,1mgrncho vào bình định mức dung tích 100ml, pha loãng và định mức bằng metanol đểrnsao cho thu được dung dịch gốc có nồng độ 1000mg/ml. Dung dịch chuẩn gốc được bảo quản trong lọ nâu ở 4⁰C,rncó thể sử dụng được trong vòng 2 tuần.

rnrn

5.2.4.2. Dung dịch chuẩn làm việc 100mg/ml.

rnrn

Hút chính xác 10ml dung dịch chuẩn gốc(5.2.4.1) vào bìnhrnđịnh mức 100ml, pha loãng và định mức đến vạch bằng metanol. Lắc đều.

rnrn

6. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

rnrn

6.1. Lấy mẫu

rnrn

Phương pháp lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này,rnnên lấy mẫu theo ISO 6497:2002. Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thí nghiệmrnphải là mẫu trung thực và có tính đại diện, không bị hư hại hoặc bị biến đổirnthành phần trong quá trình vận chuyển và bảo quản. Khối lượng mẫu phân tíchrnphải không được ít hơn 500 gam.

rnrn

6.2. Chuẩn bị mẫu

rnrn

6.2.1. Mẫu ở dạng bột mịn

rnrn

Nếu mẫu thí nghiệm ở dạng bột lọt hoàn toàn qua sàng córnkích thước lỗ sàng 1,00 mm thì trộn thật đều mẫu (500 gam) bằng máy trộn phòngrnthí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút. Sau đó chia hỗnrnhợp bằng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư cho đến khi thu được lượng mẫurnthử không dưới 100 gam.

rnrn

6.2.2. Mẫu có kích thước hạt vừa

rnrn

6.2.2.1. Nếu mẫu thí nghiệm không lọt hết qua sàng córnkích thước lỗ sàng 1,00 mm nhưng lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ 3,00rnmm thì trộn thật đều mẫu (không ít hơn 500 gam)  bằng máy trộn phòng thí nghiệmrnloại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút.

rnrn

6.2.2.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫurnđã trộn đều (6.2.2.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam.rnNghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máyrnnghiền (4.1) cho dến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00rnmm.

rnrn

6.2.3. Mẫu có kích thước hạt to.

rnrn

6.2.3.1. Nếu mẫu không lọt qua sàng có kích thước lỗ sàngrn3,00 mm thì cần nghiền mẫu (không ít hơn 500 gam) trên máy nghiền (4.1) cho đếnrnkhi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 3,00 mm, sau đó trộn thậtrnđều mẫu bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trongrnvòng 10 phút.

rnrn

6.2.3.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫurnđã trộn đều (6.2.3.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam.rnNghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máyrnnghiền (4.1) cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00rnmm.

rnrn

Các mẫu thử được bảo quản trong các lọ đựng mẫu (4.20) ởrnđiều kiện nhiệt độ 2 – 25⁰C, nơi khô ráo.

rnrn

Chú ý: Nên nghiền, trộn mẫu trong các phòng có thông gió,rnnên đeo kính, khẩu trang và găng tay bảo vệ.

rnrn

7. Cách tiến hành

rnrn

7.1. Đường chuẩn

rnrn

Hút chính xác lầnrnlượt 10, 20, 50, 100, 200 và 400mlrntừ dung dịch chuẩn làm việc (100mg/ml)rncho vào ống nghiệm (4.9), pha loãng đến 700mlrnbằng metanol và tạo dẫn xuất như các bước tiến hành ở mục 7.2. Các dung dịchrntrên sẽ có nồng độ từ 1mg/ml đến 40mg/ml tương ứng trên đồ thị chuẩn.

rnrn

7.2. Chiết mẫu và tạorndẫn xuất

rnrn

Cân chính xác đếnrn0,1mg từ 5,0g-10,0g mẫu thử đã được nghiền mịn theo mục 6 (tuỳ theo hàm lượngrnkháng sinh có trong mẫu) cho vào bình nón 125ml, thêm tiếp 50ml metanol. Tiếnrnhành chiết monensin bằng cách lắc trên máy lắc ngang (4.8) trong thời gian 1rngiờ với tốc độ 250vòng /phút. Lấy 10ml phần dịch trong ở phía trên cho vào ốngrnly tâm (4.6) và ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút. Hút 700ml dịch ở phía trên ống ly tâm cho vàornống nghiệm (4.9). Thêm tiếp 100mlrndung dịch TCA (500mg/ml). Lắc ống nghiệm trong 20 giây trên máy lắc (4.8), saurnđó để ống nghiệm ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Thêm tiếp 200ml thuốc thử DNP (1mg/ml) vào ốngrnnghiệm, và lắc 20 giây trên máy lắc (4.8). Đặt ống nghiệm vào tủ ấm có nhiệt độrnổn định 55^oC (4.7) trong 20 phút. Làm nguội ống nghiệm và dùng 10ml dung dịch này để bơm vào hệ thốngrnHPLC.

rnrn

7.3. Chuẩn bị mẫu trắng

rnrn

Mẫu trắng là mẫu thức ăn chăn nuôi được xác định là khôngrncó monensin. Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự như mẫu thử theo mục 7.2.

rnrn

7.4. Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi

rnrn

Việc xác định độ thu hồi được chuẩn bị bằng cách cho mộtrnlượng dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp được pha từ dung dịch gốc vào 5g mẫurntrắng (7.3) để đảm bảo mẫu có hàm lượng monensin nằm trong dãy đồ thị chuẩn,rnmẫu được để yên trong 30 phút trước khi tiến hành chiết xuất. Sau đó tiếp tụcrnquá trình chiết mẫu và tạo dẫn xuất tương tự như đối với mẫu thử theo mục 7.2.

rnrn

7.5. Phân tích trên HPLC

rnrn

7.5.1. Điều kiện sắc ký:

rnrn

            Nhiệt độ cột                                          30^oC

rnrn

            Detector                                               detectorrnUV bước sóng 392 nm

rnrn

Tốc độ dòng                                        1rnml/phút

rnrn

            Thể tích bơm mẫu                                 10rnml

rnrn

7.5.2. Tiến hành

rnrn

7.5.2.1. Nên sử dụngrnbảo vệ cột, việc sử dụng bảo vệ cột không có bất cứ ảnh hưởng nào đến kết quảrnphân tích.

rnrn

7.5.2.2. Cân bằng hệrnthống sắc ký bằng pha động (5.2.3) 30 phút trước khi bơm mẫu.

rnrn

7.5.2.3. Quy trìnhrnbơm mẫu theo thứ tự như sau: dịch mẫu trắng, các dung dịch chuẩn, dịch mẫu thurnhồi, dịch mẫu thử, các dung dịch chuẩn.

rnrn

Chú ý: Cần bơm cácrndịch chuẩn trước và sau mỗi đợt phân tích, không nên để quá 20 lần bơm mẫu chornmỗi đợt phân tích. Nếu quá 20 lần thì phải bơm các dung dịch chuẩn thêm lần nữarnvào khoảng giữa đợt bơm mẫu.

rnrn

7.5.2.4. Xác địnhrndiện tích pic đối với các dung dịch chuẩn và dung dịch mẫu thử tương ứng

rnrn

7.5.2.5. Sau khi chạyrnmáy phải làm sạch hệ thống HPLC bằng hỗn hợp gồm nước cất : acetonitrile theorntỷ lệ thể tích 40:60 trong 30 phút đến 1 giờ để loại hết đệm trong hệ thốngrntrước khi tắt máy.

rnrn

8.rnTính toán kết quả

rnrn

8.1. Đường chuẩn

rnrn

8.1.1. Phải đảm bảornrằng các diện tích pic của mẫu thử đều nằm trong phạm vi của đường chuẩn. Nếurnmẫu thử nào có diện tích pic vượt quá chiều cao của đường chuẩn ở nồng độ caornnhất thì sẽ bị loại và phải tiến hành thử lại với sự pha loãng.

rnrn

8.1.2. Xây dựng đườngrnchuẩn biểu thị mối quan hệ giữa diện tích pic thu được của dung dịch chuẩn vớirnnồng độ của monensin  theo quan hệ tuyến tính bậc1:

rnrn

y= ax + b

rnrn

Trong đó:                      yrnlà diện tích pic

rnrn

                                    xrnlà nồng độ của kháng sinh

rnrn

                                    arnlà hệ số góc

rnrn

                                    brnlà hằng số

rnrn

8.2. Tính toán

rnrn

8.2.1. Hàm lượngrnmonensin có trong mẫu thử được tính toán dựa vào đường chuẩn hồi qui tuyến tínhrn(8.1.2) theo công thức sau:

rnrn

rnrn

Trong đó:          Xrnlà hàm lượng monensin có trong mẫu thử, tính bằng mg/kg

rnrn

Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết mẫu thử vàrndiện tích pic của mẫu trắng

rnrn

                        a,rnb là các thông số của đường chuẩn y = ax + b

rnrn

                        Vrnlà thể tích dịch chiết mẫu (7.2), tính bằng ml

rnrn

                        mrnlà khối lượng mẫu thử, tính bằng gam

rnrn

8.2.2. Kết quả cuốirncùng là giá trung bình của hai lần phân tích nhắc lại. Trong quá trình tínhrntoán luôn phải lấy hai số sau dấu phẩy. Giá trị trung bình được làm tròn đếnrnmột chữ số thập phân.

rnrn

8.2.3. Xác định độrnthu hồi (R) tính theo phần trăm theo công thức sau:

rnrn

rnrn

Trong đó:

rnrn

C₁ là hàmrnlượng monensin xác định được theo quy trình phân tích (tính bằng mg/kg)

rnrn

C là hàm lượngrnmonensin được nạp thêm vào mẫu (tính bằng mg/kg).

rnrn

Độ thu hồi được xácrnđịnh cho mỗi lần chạy mẫu ít nhất phải đạt 80%.

rnrn

9.rnBáo cáo thử nghiệm

rnrn

Báo cáo kết quả phảirnbao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:

rnrn

– Mọi thông tin cầnrnthiết để nhận biết mẫu thử.

rnrn

– Viện dẫn của tiêurnchuẩn này hoặc phương pháp thử.

rnrn

– Kết quả và đơn vịrnbiểu thị kết quả.

rnrn

– Ngày tháng lấy mẫurnvà kiểu loại lấy mẫu (nếu có).

rnrn

– Ngày tháng thửrnnghiệm.

rnrn

– Các điểm đặc biệtrnquan sát được trong quá trình thử nghiệm.

rnrn

– Mọi thao tác khôngrnqui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tuỳ chọn, cùng với các chi tiếtrncủa sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.

rnrn