Tiêu chuẩn ngành 10TCN 834:2006 về thức ăn chăn nuôi – xác định hàm lượng zinc bacitracin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao do Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ban hành

TIÊU CHUẨN NGÀNH

rnrn

rnrn

10TCN 834:2006

rnrn

THỨC ĂN CHĂN NUÔI – XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ZINCrnBACITRACIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

rnrn

Animalrnfeeding stuffs – Determination of Zinc bacitracin content by high – performance liquidrnchromatographic method

rnrn

(Ban hành kèm theornQuyết định số 4099/QĐ/BNN-KHCN ngày 29 tháng 12 năm 2006 của Bộ trưởng Bộ Nôngrnnghiệp và Phát triển nông thôn)

rnrn

1.rnPhạm vi áp dụng

rnrn

Tiêu chuẩn này áp dụng để phân tích hàm lượng kháng sinhrnZinc bacitracin (Zn- bacitracin) trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp sắcrnký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 5mg/kg.

rnrn

2. Tài liệu viện dẫn

rnrn

Các tài liệu viện dẫn sau đây rất cần thiết cho việc áprndụng tiêu chuẩn. Đối với các tài liệu viện dẫn ghi năm ban hành thì áp dụngrnphiên bản được nêu. Đối với các tài liệu viện dẫn không ghi năm ban hành thì áprndụng phiên bản mới nhất, bao gồm cả các sửa đổi:

rnrn

TCVN 4851 (ISO 3696). Nước dùng để phân tích trong phòngrnthí nghiệm. Yêu cầu kỹ thuật và phương pháp thử.

rnrn

ISO 6497:2002 (E). Thức ăn chăn nuôi. Lấy mẫu. (Animalrnfeeding stuffs – Sampling).

rnrn

3.rnNguyên tắc

rnrn

Zn-bacitracin trong mẫu thức ăn chăn nuôi được chiết bằngrndung môi axit hóa. Dịch chiết được ly tâm, lọc và phân tích trên hệ thống sắcrnký lỏng hiệu năng cao với detector UV ở bước sóng 254nm.

rnrn

4.rnThiết bị, dụng cụ

rnrn

4.1. Máy nghiền mẫu phòng thí nghiệm.

rnrn

4.2. Sàng phòng thí nghiệm, có kích thước lỗ sàng 1,00 mmrnvà 3,00 mm.

rnrn

4.3. Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g.

rnrn

4.4. Cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01 g.

rnrn

4.5. Máy ly tâm lạnh có tốc độ 3000rnvòng/phút, sử dụng ống ly tâm dung tích 30 ml.

rnrn

4.6. ống ly tâm, dung tích 30 ml bằng polypropylen hoặcrnbằng thuỷ tinh, có nắp đậy.

rnrn

4.7. Máy lắc tròn hoặc máy lắc ngang có thể đạt tốc độrn250 vòng/phút.

rnrn

4.8. Máy đo pH có độ chính xác đến 0,05 đơn vị.

rnrn

4.9. Bình định mức dung tích 10, 100, 1000 ml.

rnrn

4.10. Pipet tự động điều chỉnh được từ  1ml đến 10 ml.

rnrn

4.11. Micropipet dung tích từ 10 ml đến 100 ml và 200ml đến 1000ml.

rnrn

4.12. Hút dung môi tự động 2 ml, 10 ml, 20 ml.

rnrn

4.13. Máy lắc ống nghiệm (Vortex mixer).

rnrn

4.14. ống đong 1000ml.

rnrn

4.15. Bình nón dung tích 125ml.

rnrn

4.16. Bể siêu âm.

rnrn

4.17. Bơm  hút chân không.

rnrn

4.18. Màng lọc syranh có kích thước 0,45 mm.

rnrn

4.19. Lọ nhỏ dựng dịch mẫu chuyên dụng cho HPLC, có nắprnvặn PTFE .

rnrn

4.20. Thiết bị trộn mẫu phòng thí nghiệm loại HobartrnModel C 100 T hoặc tương đương.

rnrn

4.21. Thiết bị chia mẫu:

rnrn

Thiếtrnbị chia đôi hoặc chia tư mẫu: ví dụ như thiết bị chia tư hình nón, thiết bịrnchia nhiều ngăn có hệ thống phân hạt hoặc các thiết bị chia khác đảm bảo phânrnchia mẫu thí nghiệm thành mẫu thử đồng nhất.

rnrn

4.22. Hộp đựng mẫu córnnắp kín.

rnrn

4.23. Hệ thống HPLC gồm có:

rnrn

4.23.1. Máy sắc kírnlỏng hiệu năng cao, bình chứa dung môi, hệ thống bơm mẫu, detector UV đặt đượcrnở bước sóng 254nm, máy ghi hoặc bộ tích phân.

rnrn

4.23.2. Cột phân tích HPLC pha đảo có kèm cột bảo vệ

rnrn

            Chiều dài                         150mm

rnrn

            Đường kính trong            4,6mm

rnrn

            Hạt nhồi                           C 18; 5mm hoặc tương đương

rnrn

5. Hóa chất và thuốc thử

rnrn

5.1. Hoá chất

rnrn

Chỉ sử dụng hoá chất được công nhận đạt chất lượng tinhrnkhiết phân tích và nước cất cấp hạng 1 theo TCVN 4851 (ISO 3696). Các dung môirnphải đạt chất lượng để dùng cho phân tích HPLC.

rnrn

5.1.1. Acetonitrile.

rnrn

5.1.2. Metanol.

rnrn

5.1.3. Kali dihydrophosphat (KH₂PO₄).

rnrn

5.1.4. Kali hydrophosphat (K₂HPO₄).

rnrn

5.1.5. Dinatri ethylen diamin tetraacetic (Na₂EDTA.2H₂O).

rnrn

5.1.6. Axitrnphotphoric (85%).

rnrn

5.1.7. Chất chuẩn Zn-bacitracin: loại tinh khiết, có kèmrntheo giấy chứng nhận hàm lượng (theo đơn vị hoạt tính, không ít hơn 42 iurnbacitracin/mg) .

rnrn

5.2. Thuốc thử

rnrn

5.2.1. Dung dịch đệm phosphat- EDTA- pH 4,5.

rnrn

Cân 13,6g kali dihydrophosphat và 2,5g dinatri ethylenrndiamin tetraacetic với độ chính xác 0,01mg cho vào bình định mức 1000ml, hòarntan và định mức đến vạch bằng nước cất. Lắc đều dung dịch.

rnrn

5.2.2. Dung dịch đệm phosphat- pH 6,0.

rnrn

Cân 1,5g Kali hydrophosphat và 8,5g kali dihydrophosphatrnvới độ chính xác 0,01mg cho vào bình định mức 1000ml, hòa tan và định mức đếnrnvạch bằng nước cất. Lắc đều dung dịch.

rnrn

5.2.3. Dung dịch natri hydroxit 0,1mol/l

rnrn

5.2.4. Các dung môi

rnrn

5.2.4.1. Chuẩn bị dung môi chiết và các dung môi A, Brnbằng cách trộn các hóa chất và thuốc thử theo tỉ lệ phần trăm thể tích (v/v)rnnhư bảng 1 sau:

rnrn

Bảng 1: Tỉ lệ pha các hỗn hợp dung môi

rnrn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rnrn

5.2.4.2. Cách pha các dung môi

rnrn

Lấy một lượng các hóa chất, thuốc thử theo tỉ lệ phầnrntrăm thể tích (v/v) như ở bảng 1 cho vào bình định mức 1000ml và thêm nước cấtrnđến vạch mức. Lắc đều dung dịch.

rnrn

5.2.5. Pha động

rnrn

Pha động dùng trong phân tích đượcrnchuẩn bị bằng cách trộn 590ml dung môi B (bảng 1) với 410ml dung môi A vào ống đongrn1000ml. Trộn đều và điều chỉnh đến pH 6,8 bằng dung dịch natri hydroxitrn0,1mol/l. Nếu cần thiết có thể điều chỉnh thể tích dung môi B để thu được sựrnphân giải pic tốt nhất. Sau đó lọc hỗn hợp dung dịch thu được qua phễu hút chânrnkhông với màng lọc có kích thước lỗ 0,45 mm,rnsiêu âm đuổi khí ở nhiệt độ thường trong 30 phút.

rnrn

5.2.6. Dung dịch chuẩn

rnrn

5.2.6.1. Dung dịch chuẩn gốc 1000mg/ml

rnrn

Tùy theo hàm lượng bacitracin ghi trong giấy chứng nhậnrn(5.1.7), cân một lượng nhất định chất chuẩn Zn-bacitracin chính xác đến 0,1mgrncho vào bình định mức dung tích 100ml, pha loãng và định mức bằng dung môirnchiết (bảng1) để sao cho thu được dung dịch có nồng độ 1000mg/ml. Dung dịch chuẩn gốc được bảornquản trong lọ sẫm màu ở 4⁰C, có thể sử dụng được trong vòng 1 tuần.

rnrn

5.2.6.2. Dãy dung dịch chuẩn phân tích sắc ký: 10, 20, 50rnvà 100 mg/ml

rnrn

Cácrndung dịch xây dựng đường chuẩn được chuẩn bị trong ngày bằng cách hút chính xácrnlần lượt 100, 200, 500 và 1000mlrndung dịch chuẩn gốc 1000mg/ml (5.2.6.1) chornvào các bình định mức dung tích 10ml, pha loãng và định mức đến vạch bằng dungrnmôi chiết (bảng 1).

rnrn

Chú ý: Nếu sau khi pha 3 giờ mà chưa sử dụng, cần bảornquản các dung dịch chuẩn trên ở 4^oC. Nhưng tốt nhất là pha các dungrndịch chuẩn này, sau đó bảo quản trong tủ lạnh ít nhất 30 phút trước khi phânrntích và chỉ đưa ra ngay trước khi chạy sắc kí.

rnrn

6. Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

rnrn

6.1. Lấy mẫu

rnrn

Phươngrnpháp lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này, nên lấy mẫu theo ISO 6497:rn2002. Điều quan trọng là mẫu gửi đến phòng thí nghiệm phải là mẫu trung thực vàrncó tính đại diện, không bị hư hại hoặc bị biến đổi thành phần trong quá trìnhrnvận chuyển và bảo quản. Khối lượng mẫu phân tích phải không được ít hơn 500rngam.

rnrn

6.2. Chuẩn bị mẫu

rnrn

6.2.1. Mẫu ở dạng bột mịn

rnrn

Nếurnmẫu thí nghiệm ở dạng bột lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00 mmrnthì trộn thật đều mẫu (500 gam) bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút. Sau đó chia hỗn hợp bằng thiết bị chia đôirnhoặc thiết bị chia tư cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam.

rnrn

6.2.2. Mẫu có kích thước hạt vừa

rnrn

6.2.2.1. Nếu mẫu thí nghiệm không lọt hết qua sàng córnkích thước lỗ sàng 1,00 mm nhưng lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ 3,00rnmm thì trộn thật đều mẫu (không ít hơn 500 gam)  bằng máy trộn phòng thí nghiệmrnloại Hobart (hoặc tương đương) trong vòng 10 phút.

rnrn

6.2.2.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫurnđã trộn đều (6.2.2.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam.rnNghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máyrnnghiền (4.1) cho dến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00rnmm.

rnrn

6.2.3. Mẫu có kích thước hạt to.

rnrn

6.2.3.1. Nếu mẫu không lọt qua sàng có kích thước lỗ sàngrn3,00 mm thì cần nghiền mẫu (không ít hơn 500 gam) trên máy nghiền (4.1) cho đếnrnkhi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 3,00 mm, sau đó trộn thậtrnđều mẫu bằng máy trộn phòng thí nghiệm loại Hobart (hoặc tương đương) trongrnvòng 10 phút.

rnrn

6.2.3.2. Dùng thiết bị chia đôi hoặc thiết bị chia tư mẫurnđã trộn đều (6.2.3.1) cho đến khi thu được lượng mẫu thử không dưới 100 gam.rnNghiền lượng mẫu này cẩn thận trong máyrnnghiền (4.1) cho đến khi mẫu lọt hoàn toàn qua sàng có kích thước lỗ sàng 1,00rnmm.

rnrn

Các mẫu thử được bảo quản trong các lọ đựng mẫu (4.19) ởrnđiều kiện nhiệt độ 2 – 25⁰C, nơi khô ráo.

rnrn

Chú ý: Nên nghiền, trộn mẫu trong các phòng có thông gió,rnnên đeo kính, khẩu trang và găng tay bảo vệ.

rnrn

7. Cách tiến hành

rnrn

7.1. Chiết xuất mẫu

rnrn

Cân chính xác đếnrn0,1mg từ 1,0g – 5,0g mẫu thử đã được nghiền mịn theo mục 6 (tuỳ theo hàm lượngrnkháng sinh có trong mẫu) cho vào bình nón 125ml, thêm 50ml dung môi chiết (bảngrn1). Tiến hành chiết Zn-bacitracin bằng cách lắc trên máy lắc trong thời gian 20rnphút ở tốc độ 250 vòng/phút. Lấy 10ml phần dịch chiết chuyển vào ống ly tâmrn(4.6) và ly tâm trong 10 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút. Thu lấy dịch trong vàrncho qua màng lọc 0,45mm vào lọ nhỏ chuyênrndụng cho HPLC (4.19) để phân tích trên hệ thống sắc kí.

rnrn

Chú ý: Nếu sau khi pha 3 giờ mà chưa sử dụng, cần bảornquản dịch trong thu được sau khi lọc ở 4^oC. Nhưng tốt nhất nên chiếtrnmẫu và bảo quản trong tủ lạnh ít nhất 30 phút trước khi phân tích và chỉ đưa rarnngay trước khi chạy sắc kí.

rnrn

7.2. Chuẩn bị mẫu trắng

rnrn

Mẫu trắng là mẫu thức ăn chăn nuôi được xác định là khôngrncó Zn-bacitracin. Mẫu trắng được chuẩn bị tương tự như mẫu thử theo mục 7.1.

rnrn

7.3. Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi

rnrn

Việc xác định độ thu hồi được chuẩn bị bằng cách cho mộtrnlượng dung dịch chuẩn có nồng độ thích hợp được pha từ dung dịch gốc vào 5g mẫurntrắng (7.2) để đảm bảo mẫu có hàm lượng Zn-bacitracin nằm trong dãy đồ thịrnchuẩn, mẫu được để yên trong 30 phút trước khi tiến hành chiết xuất. Sau đórntiếp tục quá trình chiết mẫu tương tự như đối với mẫu thử theo mục 7.1.

rnrn

7.4. Phân tích trên HPLC

rnrn

7.4.1. Điều kiện sắc ký:

rnrn

            Nhiệt độ cột                                          nhiệtrnđộ phòng

rnrn

            Detector                                               detectorrnUV bước sóng 254 nm

rnrn

Tốc độ dòng                                        1rnml/phút

rnrn

            Thể tích bơm mẫu                                 20rnml

rnrn

7.4.2. Tiến hành

rnrn

7.4.2.1. Nên sử dụngrnbảo vệ cột, việc sử dụng bảo vệ cột không có bất cứ ảnh hưởng nào đến kết quảrnphân tích.

rnrn

7.4.2.2. Cân bằng hệrnthống sắc ký bằng pha động (5.2.5) 30 phút trước khi bơm mẫu.

rnrn

7.4.2.3. Quy trìnhrnbơm mẫu theo thứ tự như sau: dịch mẫu trắng, các dung dịch chuẩn, dịch mẫu thurnhồi, dịch mẫu thử, các dung dịch chuẩn.

rnrn

CHÚ Ý: Cần bơm cácrndịch chuẩn trước và sau mỗi đợt phân tích, không nên để quá 20 lần bơm mẫu chornmỗi đợt phân tích. Nếu quá 20 lần thì phải bơm các dung dịch chuẩn thêm lần nữarnvào khoảng giữa đợt bơm mẫu.

rnrn

7.4.2.4. Xác địnhrnchiều cao tổng cộng của 4 pic tương ứng với thành phần zn- bacitracin của dungrndịch thang chuẩn và của mẫu thử tương ứng.

rnrn

7.4.2.5. Sau khi chạyrnmáy phải làm sạch hệ thống HPLC bằng hỗn hợp gồm nước cất : axetonnitril theorntỷ lệ thể tích 40:60 trong 30 phút để loại hết đệm trong hệ thống trước khi tắtrnmáy.

rnrn

8.rnTính toán kết quả

rnrn

8.1. Đường chuẩn

rnrn

8.1.1. Phải đảm bảornrằng các chiều cao pic của mẫu thử đều nằm trong phạm vi của đường chuẩn. Nếurnmẫu thử nào có chiều cao pic vượt quá chiều cao của đường chuẩn ở nồng độ caornnhất thì sẽ bị loại và phải tiến hành thử lại với sự pha loãng.

rnrn

8.1.2.rnXây dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa chiều cao pic thu được của dungrndịch chuẩn với nồng độ của Zn-bacitracin theo quan hệ tuyến tính bậc 1:

rnrn

yrn= ax + b

rnrn

Trong đó:

rnrn

                        yrnlà chiều cao pic

rnrn

                        xrnlà nồng độ của kháng sinh

rnrn

                        arnlà hệ số góc

rnrn

                        brnlà hằng số

rnrn

8.2. Tính toán

rnrn

8.2.1. Hàm lượngrnZn-bacitracin có trong mẫu thử được tính toán dựa vào đường chuẩn hồi qui tuyếnrntính (8.1.2) theo công thức sau:

rnrn

rnrn

Trong đó:          Xrnlà hàm lượng Zn-bacitracin có trong mẫu thử, tính bằng mg/kg

rnrn

Y là hiệu số giữa chiều cao pic của dịch chiết mẫu thử vàrnchiều cao pic của mẫu trắng

rnrn

                        a,rnb là các thông số của đường chuẩn y = ax + b

rnrn

                        Vrnlà thể tích dịch chiết mẫu (7.1), tính bằng ml

rnrn

                        mrnlà khối lượng mẫu thử, tính bằng gam

rnrn

8.2.2. Kết quả cuốirncùng là giá trung bình của hai lần phân tích nhắc lại. Trong quá trình tínhrntoán luôn phải lấy hai số sau dấu phẩy. Giá trị trung bình được làm tròn đếnrnmột chữ số thập phân.

rnrn

8.2.3. Xác định độrnthu hồi (R) theo công thức sau:

rnrn

rnrn

Trong đó:

rnrn

C₁rnlà hàm lượng Zn-bacitracin xác định được theo quy trình phân tích (tính bằngrnmg/kg).

rnrn

C là hàmrnlượng Zn-bacitracin được nạp thêm vào mẫu (tính bằng mg/kg).

rnrn

Độ thu hồi được xácrnđịnh cho mỗi lần chạy mẫu ít nhất phải đạt 80%.

rnrn

9.rnBáo cáo thử nghiệm

rnrn

Báo cáo kết quả phảirnbao gồm ít nhất các thông tin dưới đây:

rnrn

– Mọi thông tin cầnrnthiết để nhận biết mẫu thử.

rnrn

– Viện dẫn của tiêurnchuẩn này hoặc phương pháp thử.

rnrn

– Kết quả và đơn vịrnbiểu thị kết quả.

rnrn

– Ngày tháng lấy mẫurnvà kiểu loại lấy mẫu (nếu có).

rnrn

– Ngày tháng thửrnnghiệm.

rnrn

– Các điểm đặc biệtrnquan sát được trong quá trình thử nghiệm.

rnrn

– Mọi thao tác khôngrnqui định trong tiêu chuẩn này, hoặc được coi là tuỳ chọn, cùng với các chi tiếtrncủa sự cố bất kỳ mà có thể ảnh hưởng đến kết quả.

rnrn