Tiêu chuẩn ngành 10 TCN 815:2006 về quy trình chẩn đoán bệnh dịch tả vịt

TIÊU CHUẨNrnNGÀNH

rnrn

10 TCNrn815:2006

rnrn

QUYrnTRÌNH CHẨN ĐOÁN BỆNH DỊCH TẢ VỊT

rnrn

Protocol for duckrnvirus enteritis diagnosis

rnrn

1. Phạmrnvi áp dụng:

rnrn

Quy trìnhrnnày được áp dụng để chẩn đoán bệnh Dịch tả vịt tại các phòng thírnnghiệm chẩn đoán bệnh động vật.

rnrn

2.rnKhái niệm

rnrn

– Bệnh Dịch tảrnvịt (Duck Virus Enteritis ) là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểmrnxảy ra ở vịt, ngan, ngỗng các lứa tuổi.

rnrn

– Nguyênrnnhân gây bệnh do herpes virus.

rnrn

3.rnLấy mẫu:

rnrn

3.1. Lấyrnmẫu:

rnrn

Mẫu bệnhrnphẩm lấy từ vịt nghi mắc bệnh là:

rnrn

– Gan,rnlách, thận (đối với vịt chết lấy mẫu trong vòng 24h).

rnrn

– Huyếtrnthanh.

rnrn

3.2. Bảornquản và gửi mẫu bệnh phẩm

rnrn

– Mẫurnđược lấy ngay sau khi mổ khám.

rnrn

– Mẫurnđược lấy vào lọ hoặc túi nylon sạch.

rnrn

– Dánrnnhãn.

rnrn

– Bảornquản mẫu ở nhiệt độ 4-8^oC.

rnrn

– Córnphiếu gửi bệnh phẩm.

rnrn

4.rnMáy móc – Dụng cụ – Hoá chất – Nguyên liệu

rnrn

4.1. Máyrnmóć:

rnrn

– Tủrnlạnh âḿ: -15 đến -20^oC.

rnrn

– Tủrnlạnh thường: +2 đến +8^oC.

rnrn

– Tủ ấm.

rnrn

– Tủ ấm CO₂.

rnrn

– Máy lắc đĩarn(orbital shaker).

rnrn

– Máyrnlắc trộn (vortex mixer).

rnrn

– Máyrnkhuấy từ.

rnrn

– Nồi đunrncách thuỷ (water bath).

rnrn

– Buồng cấy BSCrn(Bio-safety cabinet).

rnrn

– Máy ly tâm.

rnrn

– Máy hút chânrnkhông.

rnrn

– Đèn soi trứng.

rnrn

– Tủ ấp trứng.

rnrn

4.2. Dụng cụ:

rnrn

– Bình tam giácrncác cỡ: 100, 200, 500 và 1000 ml.

rnrn

– ống đong thuỷrntinh các cỡ: 50, 100, 200, 500 và 1000 ml.

rnrn

– Cốc có mỏ cácrncỡ: 100, 200, 500 và 1000 ml.

rnrn

– ống nghiệm.

rnrn

– Lọ nhỏ chắtrnhuyết thanh.

rnrn

– Pipet thuỷ tinh:rn1, 5 và 10 ml.

rnrn

– Micropipet đơn:rn0,5-10, 5-40, 40-200, 200-1000 ml.

rnrn

– Micropipet nhiềurnđầu (8-12): 5-50, 50-300 ml.

rnrn

– Cối chày sứ.

rnrn

– Khăn bông.

rnrn

– Dao, kéo, panhrnkẹp.

rnrn

– Khuấy từ.

rnrn

– Dụng cụ nuôi cấyrntế bào: lọ nhựa T25, đĩa nhựa 96 lỗ, đĩa nuôi cấy 6 lỗ, 24 lỗ.

rnrn

– Màng lọc Milliporrn0,45mm.

rnrn

– Đĩa petri.

rnrn

4.3. Hoá chất (hóa chất phân tíchrntinh khiết dành cho phòng thí nghiệm)

rnrn

– Nước cất hoặcrnnước khử ion.

rnrn

– NaCl.

rnrn

– KCl.

rnrn

– Na₂HPO₄.

rnrn

– KH₂PO₄.

rnrn

– NaHCO3

rnrn

-rnChloroform.

rnrn

– Tris/HCl

rnrn

– EDTA

rnrn

– Hoárnchất để tiêu độc, tiệt trùng: Formalin, Chloramin.

rnrn

4.4.rnNguyên liệu:

rnrn

– Môirntrường nuôi cấy tế bào:

rnrn

+ L-glutamine

rnrn

+ TPB – Tryptose Photphat Broth

rnrn

+ Trypsine

rnrn

+ Eagle’s minimumrnessential medium (MEM)

rnrn

+ Tryptose Photphat Broth (TPB)

rnrn

+ Fetal calf serum (FCS).

rnrn

– Kháng sinh:rnPenicillin, Streptomycin, Kanamycin.

rnrn

– Vịt con 1-7 ngàyrntuổi.

rnrn

– Trứng vịt córnphôi (11-12 ngày tuổi).

rnrn

– Trứng vịt córnphôi (9-10 ngày tuổi): dùng để làm tế bào xơ phôi vịt (DEF – DuckrnEmbryo Fibroblast).

rnrn

– Giống virus Dịchrntả vịt.

rnrn

– Kháng huyết thanhrnDịch tả vịt.

rnrn

rnrn

5.1. Kiểm tra một số đặc điểm dịch tễrnhọc – triệu chứng:́́

rnrn

– Tìm hiểu bệnh sửrnvà truyền lây của bệnh như:

rnrn

+ Bệnh xảy ra ởrnvịt, ngan, ngỗng mọi lứa tuổi.

rnrn

+ Bệnh lây lan nhanhrnvà trầm trọng trong khoảng 2-3 ngày.

rnrn

– Kiểm tra triệurnchứng:

rnrn

+ Giảm ăn, mấtrnthăng bằng, ỉa phân loãng, xù lông.

rnrn

+ Mắt có dử, mírnmắt sưng, sợ ánh sáng, chảy nước mũi.

rnrn

5.2 Kiểm tra bệnhrntích:

rnrn

– Kiểm tra bệnhrntích đại thể:rn

rnrn

+ Ở vịt trưởngrnthành có hiện tượng gan bị bạc màu. ở con đực trưởng thành có thểrnxảy ra hiện tượng dương vật bị thay đổi vị trí, ở con cái quan sátrnthấy các nang trứng bị xuất huyết.

rnrn

+ Mạch máu bị tổnrnthương, tổn thương hệ bạch huyết, thoái hoá nhu mô. ống tiêu hoá córnnhiều chất nhờn. Đây là đặc trưng của bệnh Dịch tả vịt.

rnrn

– Kiểm trarnbệnh tích vi thể:

rnrn

+ Tổn thươngrnmạch máu và các cơ quan phủ tạng. Xuất hiện các thể vùi nội nhân,rnthể vùi tế bào chất trong các tế bào biểu mô của hệ thống tiêurnhoá. Đây là bệnh tích đặc trưng của bệnh.

rnrn

5.3. Chẩnrnđoán phòng thí nghiệm

rnrn

5.3.1. Phátrnhiện virus:

rnrn

Xử lý bệnhrnphẩm:

rnrn

– Mẫu gan,rnlách, thận đư­ợc xử lý thành huyễn dịch 10% với PBS có chứa 200rnUI/ml Penicillin và 200mg/mlrnStreptomycin.

rnrn

– Ly tâmrn2.000 vòng/15ph.

rnrn

– Lấy dịchrntrong ở trên.

rnrn

– Kiểm trarnvô trùng: trên môi trường nước thịt BHI, hoặc môi trường thạch máu.

rnrn

5.3.1.1. Phânrnlập virus:

rnrn

a. Phân lậprntrên trứng vịt có phôi:

rnrn

– Tiêm 0,2mlrnhuyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý vào xoang niệu mô hoặc màng CAM phôirnvịt 11-12ngày: 5 phôi/mẫu bệnh phẩm.

rnrn

– Trứngrnđược ấp tiếp ở tủ ấp 37^oC.

rnrn

– Soi trứng. Loạirnbỏ những phôi chết trong khoảng 24h sau khi tiêm.

rnrn

– Virus DTV gây chếtrnphôi sau 4-10 ngày với đặc trưng: Xuất huyết lan rộng.

rnrn

– Thu hoạch gan phôirnvà nư­ớc niệu để giám định virus.

rnrn

b. Phân lập trên tếrnbào xơ phôi vịt (Duck Embryo Fibroblast – DEF):

rnrn

– Cấy tế bào DEFrntrên các lọ nuôi cấy T25 hoặc đĩa nuôi cấy ( đĩa nuôi cấy 6 lỗ, 24rnlỗ), sau 2-3 ngày tế bào mọc thành thảm (khoảng 70%) thì gây nhiễmrnhuyễn dịch bệnh phẩm đã xử lý: 500µl/lỗ hoặc lọ. Việc cấy chuyển 2rnlần là cần thiết trong qúa trình phân lập.

rnrn

– Quan sát bệnhrntích tế bào (CPE-Cytopathic pathogene effect): đặc trưng với đám tế bàornto, tròn và trở nên hoại tử sau 2-4 ngày sau đó.

rnrn

– Thu hoạch hỗnrndịch tế bào, đông tan, ly tâm và thu phần nước trong cho giám địnhrnvirus.

rnrn

5.3.1.2. Phương pháprngiám định virus

rnrn

a. Phương pháp trungrnhoà trên trứng vịt có phôi (VN – Virus Nertralization):

rnrn

(phôi vịt 10-14 ngàyrntuổi).

rnrn

– Chuẩn bị:

rnrn

+ Pha loãng virusrnphân lập: Nồng độ 10^-1–10^-9 với dung dịch PBS.

rnrn

+ Lô đối chứng (+):rnTrộn kháng huyết thanh dương tính DTV với các nồng độ virus đã pharnloãng theo tỷ lệ 1:1.

rnrn

+ Lô đối chứng (-):rnTrộn huyết thanh (-) tính với các nồng độ virus đã pha loãng theo tỷrnlệ 1:1.

rnrn

+ Ủ hỗn hợp trên ởrnnhiệt độ 37^oC/1h.

rnrn

– Tiến hành:

rnrn

+ Tiêm hỗn hợp trên vào xoang niệu môrnphôi trứng (0,2ml/phôi), 5 phôi/nồng độ.

rnrn

+ Phôi được ấp tiếp ở tủ ấp 37^oCrntrong 10 ngày. Loại bỏ những phôi chết tr­ước 24h.

rnrn

+ Phôi chết xảy ra trong 4-10 ngày, córnbệnh tích còi cọc, xuất huyết lan rộng.

rnrn

– Đánh giá kếtrnquả:

rnrn

Tính toán chỉ sốrntrung hoà NI (neutralization index).

rnrn

b. Phương pháp trungrnhoà trên tế bào xơ phôi vịt (DEF):

rnrn

– Chuẩn bị:

rnrn

+ Tế bào DEF trênrnđĩa nuôi cấy tế bào 96 lỗ đã nuôi cấy đ­ược 2-3 ngày.

rnrn

+ Pha loãng virusrnphân lập: các nồng độ 10^-1–10^-9 với môi trư­ờngrnnuôi cấy MEM.

rnrn

+ Lô đối chứng (+):rntrộn kháng huyết thanh dương tính DTV với các nồng độ virus đã pharnloãng theo tỷ lệ 1:1.

rnrn

+ Lô đối chứng (-):rntrộn huyết thanh (-) tính với các nồng độ virus đã pha loãng theo tỷrnlệ 1:1.

rnrn

– Tiếnrnhành:

rnrn

+ Gâyrnnhiễm hỗn hợp trên vào đĩa đã nuôi cấy tế bào DEF (đĩa 96 lỗ),rn100µl/lỗ, 8 lỗ/nồng độ.

rnrn

+ Ủ đĩarnnuôi cấy ở tủ ấm CO₂ ở 37^oC/1h.

rnrn

+ Đổ bỏrnhỗn hợp trên, cho môi tr­ường nuôi cấy MEM 100µl/lỗ.

rnrn

+ Tiếprntục ủ đĩa nuôi cấy ở tủ ấm CO₂ ở 37^oC.

rnrn

+ Kiểmrntra bệnh lý tế bào (CPE) trong 3-7 ngày với biểu hiện tế bào to trònrnvà tụ lại thành từng đám, thời gian lâu có hiện tượng tế bào birnhoại tử.

rnrn

– Đánhrngiá kết quả:

rnrn

+ Tínhrntoán chỉ số trung hoà NI (neutralization index).

rnrn

5.3.1.3.rnPhát hiện virus Dịch tả vịt bằng phương pháp PCR:

rnrn

PCR có thể dùng đểrnphát hiện virus DTV trong các tổ chức như: Thực quản, gan và lách hoặc sau khirntiến hành phân lập trên phôi vịt.

rnrn

a. Chiết tách DNA virus:

rnrn

DNA có thể chiết tách từ dịch tế bào phân lậprnvirus, huyễn dịch bệnh phẩm 10% hoặc dịch ngoáy ổ nhớp.

rnrn

– Bước 1: Đối với huyễn dịch bệnh phẩm 10%:rnNhỏ 400 µl vào ống 1.5ml và ly tâm ở 16000 g trong 5 phút. Hút dịch nổi sangrnống mới và bắt đầu bước 2

rnrn

– Bước 2: Đối với dịch tế bào và dịch ngoáy ổrnnhớp: Nhỏ 400 µl mẫu hoặc dịch nổi từ bước trên vào ống 1.5 ml và ly tâm ởrn16000 – 20000 g trong 45 phút để lắng virus

rnrn

– Bước 3: Đổ bỏ dịch nổi và hòa tan cặn lắngrnbằng 200 µl dung dịch Tris/EDTA (10 mM Tris/HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA)

rnrn

– Bước 4: Thêm 10 µl dung dịch proteinase K 5rnµg/µl để đạt nồng độ cuối là 0,2 µg/µl, trộn đều và ủ ở 56^oC trong 1rngiờ

rnrn

– Bước 5: Thêm 25 µl dung dịch SDS 10% đểrnnồng độ cuối là 1%, trộn đều và ủ ở 37^oC trong 1 giờ.

rnrn

– Bước 6: Thêm 15 µl NaCl 5M để đạt nồng độrncuối cùng là 0,3 M và trộn đều

rnrn

– Bước 7: Thêm 300 µl dung dịch phenol đệmrnvới Tris/HCl, pH 8,0 và trộn đều (có thể bằng cách đảo lộn ống 50 lần)

rnrn

– Bước 8: Ly tâm ống ở 16000 g trong 5 phútrnvà chuyển pha nước nổi sang ống mới

rnrn

– Bước 9: Lặp lại bước 7 và 8 thêm lần nữa

rnrn

– Bước 10: Thêm 500 µl ether trộn đều, và lyrntâm ở 16000 g trong 1 phút

rnrn

– Bước 11: Hút bỏ pha nước, và lặp lại bướcrn10 1 lần nước

rnrn

– Bước 12: mở nắp ống và để ở nhiệt độ 56^oCrntrong 15 phút hoặc đến khi ngửi thấy hết mùi ether

rnrn

– Bước 13: Chia lượng mẫu trong ống làm 2, vàrnthêm lượng cồn tuyệt đối gấp 2,25 lần lượng mẫu và trộn đều, để ở nhiệt độrnphòng (22^oC) trong 30 phút

rnrn

– Bước 14: Ly tâm ở 16000 g trong 45 phút vàrnbỏ nước nổi

rnrn

– Bước 15:Thêm 200 µl cồn 70% hòa tan nhẹrnnhàng cặn lắng và lại ly tâm ở 16000 g trong 15 phút

rnrn

– Bước 16: Bỏ dịch nổi và làm khô cặn lắng ởrn56^oC trong 30-45 phút

rnrn

– Bước 17: Hòa tan DNA bằng 30 µl nước cấtrnRNAse vàDNAse free.

rnrn

– Có thể để mẫu ở 4^oC trong vàirnngày hoặc ở -20^oC nều muốn bảo quản lâu

rnrn

b. Chạy PCR

rnrn

Khi pha các hỗn hợp phản ứng nên theo hướngrndẫn của nhà sản xuất đối với phản ứng hot start PCR

rnrn

Trình tự cặp mồi (primer) dùng để phátrnhiện virus Dịch tả vịt

rnrn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rnrn

Chu trình nhân gien

rnrn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rn

rnrn

Chạy điện di sản phẩm PCR

rnrn

– Pha thạch Agar 1% bằng dung dịch đệm TAE,rnđun cho tan đều, khi đã nguội, đổ vào khuôn điện di (có lược)

rnrn

– Khi thạch đã đông, để vào trong buồng điệnrndi có đệm TAE

rnrn

– Các sản phẩm PCR được pha với dung dịchrnloading với tỷ lệ 1/10 và nhỏ vào các giếng trên miếng thạch Agar (10 µl/mẫu)

rnrn

– Chạy điện di trong 1 giờ ở nhiệt độ 120 v,rnsau đó nhuôm thạch với ethidium bromide trong 20 phút. Rửa bỏ thuốc nhuộm bằngrncách ngâm trong nước cất 45 phút và đọc kết quả bằng ánh sáng UV, chụp ảnh.

rnrn

c. Đọc kết quả:

rnrn

– Mẫu đối chứng dương và các mẫu dương tínhrncó vạch với kích cỡ 446 bp

rnrn

– Mẫu đối chứng âm và các mẫu âm tính khôngrncó vạch.

rnrn

5.3.2. Phát hiệnrnkháng thể:

rnrn

Sử dụng phươngrnpháp trung hoà (SN – Serum Nertralization) để phát hiện kháng thể:rnPhương pháp này được thực hiện trên trứng vịt có phôi, hoặc trên tếrnbào DEF

rnrn

Mẫu: là huyếtrnthanh vịt nghi mắc bệnh.

rnrn

5.3.2.1. Trên trứngrnvịt có phôi:rn10-14 ngày tuổi.

rnrn

– Chuẩn bị:

rnrn

+ Xử lý mẫu huyếtrnthanh ở 56^oC /30p.

rnrn

+ Pha loãng mẫurnhuyết thanh theo cơ số 2 ở 10 nồng độ (1/5, 1/10,…1/2560).

rnrn

+ Pha loãng virusrnDTV liều 100 EID₅₀.

rnrn

– Tiến hành:

rnrn

+ Trộn virus DTV vàrnhuyết thanh kiểm tra đã chuẩn bị ở trên theo tỷ lệ 1:1

rnrn

+ Ủ hỗn hợp khángrnnguyên – kháng thể ở tủ ấm 37^oC/1h .

rnrn

+ Tiêm hỗn hợp trênrnvào xoang niệu mô phôi trứng (0,2ml/phôi), 5 phôi/nồng độ.

rnrn

+ Trứng được ấprntiếp ở 37^oC trong 14 ngày.

rnrn

+ Soi trứng. Loạirnbỏ những phôi chết tr­ước 24h.

rnrn

– Đánh giá kếtrnquả:

rnrn

+ Phôi chết xảy rarntrong 4-10 ngày với bệnh tích còi cọc, xuất huyết lan rộng.

rnrn

+ Tính toán chỉrnsố trung hoà NI và hiệu giá trung hoà theo công thức của Reed vàrnMuench

rnrn

5.3.2.2. Trên tếrnbào xơ phôi vịt DEF:

rnrn

– Chuẩn bị:

rnrn

+ Làm và pha loãngrntế bào DEF với số lư­ợng cần thiết (4×10⁵ tế bào/ml).

rnrn

+ Xử lý mẫu huyếtrnthanh ở 56^oC /30p.

rnrn

+ Pha loãng virusrnDTV chuẩn liều 100 TCID₅₀(50% Tissue culture infective dose).

rnrn

– Tiến hành: Trênrnđĩa nuôi cấy 96 lỗ.

rnrn

+ Cho môi tr­ườngrnnuôi cấy MEM: 50µl/lỗ vào các lỗ của đĩa.

rnrn

+ Cho mẫu huyếtrnthanh kiểm tra: 50µl vào lỗ đầu tiên, cột 1.

rnrn

+ Pha loãng mẫurnhuyết thanh theo cơ số 2 (1/2, 1/4,…) từ cột 1-12.

rnrn

+ Cho virus DTVrnchuẩn liều 100 TCID₅₀ : 50µl/lỗ.

rnrn

+ Ủ đĩa nuôi cấy ởrntủ ấm CO₂ ở 37^oC/1h .

rnrn

+ Đổ bỏ hỗn hợprntrên, cho môi trường MEM (không bổ sung FCS) 100µl/lỗ.

rnrn

+ Ủ tiếp đĩa nuôirncấy ở tủ ấm CO₂ ở 37^oC trong 5-7 ngày.

rnrn

– Đánh giá kếtrnquả:

rnrn

+ Kiểm tra bệnh lýrntế bào (CPE) trong 3-7 ngày. Tế bào có biểu hiện to tròn và tụ lạirntừng đám, thời gian lâu có hiện tượng tế bào bị hoại tử.

rnrn

+ Tính toán chỉrnsố trung hoà NI và hiệu giá trung hoà theo công thức của Reed vàrnMuench.

rnrn

6.rnKết luận:

rnrn

– Nếu kết quả phânrnlập và giám định (bằng phương pháp trung hòa VN) dương tính với khángrnhuyết thanh chuẩn, kết luận có virus Dịch tả vịt.

rnrn

– Nếu kết quả PCRrndương tính, kết luận dương tính virus Dịch tả vịt.

rnrn

– Nếu thủy cầm chưarntiêm phòng, phát hiện có kháng thể Dịch tả vịt (bằng phương pháp trungrnhòa SN), kết luận thuỷ cầm đã nhiễm virus Dịch tả vịt.

rnrn

– Nếu kết quả phân lập âm tính, PCR âmrntính, kết luận âm tính virus Dịch tả vịt.

rnrn

7. Tài liệu tham khảo

rnrn

1. Manual of standards for diagnosis testsrnand vaccines (OIE).

rnrn

2. Manual of standards for diagnosis tests (Thailand).

rnrn

rnrn

PHỤrnLỤC

rnrn

1. Công thức pha môi trường:

rnrn

• Dung dịch PBSx10:

rnrn

Thành phần:

rnrn

NaCl                             80,0gr

rnrn

KCl                               rn2,0gr

rnrn

Na₂HPO4                      11,5gr

rnrn

KH₂PO4                        2,0gr

rnrn

Pha loãng vớirn1000ml n­ước cất, điều chỉnh pH = 7,2.

rnrn

Hấp tiệt trùng,rnbảo quản ở 4^oC.

rnrn

• 7% NaHCO₃:

rnrn

Thành phần:

rnrn

NaHCO₃                        7gr

rnrn

N­ước cất                      100ml

rnrn

Hấp tiệt trùng vàrnbảo quản ở 4^oC.

rnrn

• 3% L-glutamine:

rnrn

Thành phần:

rnrn

L-glutamine                   3rngr

rnrn

N­ướcrncất                      100ml

rnrn

Lọc vôrntrùng, bảo quản ở -20^oC. Pha loãng virus VGV chuẩn liều 100rnTCID₅₀.

rnrn

• TPB – TryptosernPhotphat Broth:

rnrn

• Thành phần:

rnrn

Tryptose Photphat          29,5gr

rnrn

Nước cất                      rn1000ml

rnrn

Hấp tiệt trùng,rnbảo quản ở 4^oC.

rnrn

• Trypsine 2,5% (10x):

rnrn

Thành phần:

rnrn

Trypsine                        2,5gr

rnrn

PBS                             100ml

rnrn

Lắc quarnđêm ở 4^oC, lọc vô trùng và bảo quản ở -20^oC.

rnrn

• Môi tr­ườngrnnuôi cấy tế bào MEM:

rnrn

Thànhrnphần:

rnrn

Eagle’srnminimum essential medium (MEM)         430 ml

rnrn

Tryptose PhotphatrnBroth (TPB)                          50 ml

rnrn

3% L-glutamine                                     rn           5 ml

rnrn

7% NaHCO₃                                          rn           5 ml

rnrn

Kháng sinh (Peni. +rnStrep.)                                5 ml

rnrn

Fetal calf serumrn(FCS)                                      5 ml

rnrn

2. Phương pháp làmrntế bào Xơ phôi vịt

rnrn

Sử dụng phôi vịt 9rn-10 ngày tuổi.

rnrn

1 – Mổ trứng, lấyrnphôi vịt.

rnrn

2 – Rửa phôi trongrndung dịch PBS có chứa 1% kháng sinh.

rnrn

3 – Cắt bỏ đầu,rnchân, cánh và các cơ quan phủ tạng, thu hoạch gan phôi.

rnrn

4 – Rửa phôi 1-2rnlần trong dung dịch PBS có chứa 1% kháng sinh.

rnrn

5 – Cắt nhỏ phôi.

rnrn

6 – Tách tế bàornbằng dung dịch Trypsine ấm 0,25% và lắc nhẹ 250v/p trong 15 phút.

rnrn

7 – Thu hoạch tếrnbào đã tách cho vào môi trư­ờng MEM + 10% huyết thanh FCS, bảo quảnrntrong phích đá.

rnrn

8 – Nhắc lại bướcrn6-7.

rnrn

9 – Ly tâm huyễnrndịch tế bào 1500v/p, ở 4^oC trong 5 phút.

rnrn

10 – Rửa 1 lần vớirnmôi trường nuôi cấy.

rnrn

11 – Đếm và pharnloãng tế bào với môi trường phát triển (MEM + 10% FCS), lượng tế bàorncần thiết tối thiểu 4×10⁵ tế bào/ml.

rnrn

rnrn

4. Công thức tínhrnchỉ số trung hoà NI của Reed and Muench.

rnrn

4.1. Phương pháprntrung hoà virus (VN):

rnrn

Dựa theo ví dụrnsau:

rnrn

rnrn

*: số chết/số tiêm.

rnrn

Chỉ số NI là sự chênh lệch giữa EID50rn(hoặc LD50, TCID50)của lô đối chứng (+) và (-)

rnrn

Chỉ số NI = 4.0

rnrn

rnrn

rnrn

rnrn